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标题:[求助]细胞内钙离子测定荧光染料Fura-2/am负载不上

wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-6-26 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞内钙离子测定荧光染料Fura-2/am负载不上



我现在正在进行细胞内钙离子的测定
染料一直负载不上
请教各位成功做过的朋友
你们有啥比较好的负载方法

我开始时单独在pbs细胞悬液中加染料,效果不好
后来加入了0.2%的牛血清白蛋白,还是不行

再就是染料如果过期了会有啥现象
比如激发波长不会变化等等
多谢啦
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-6-26 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.细胞悬液( 1.5ML HBSS+0.5 ml 血清)中加入 终浓度为2--5 μmol/L(自己摸索)Fura-2/am转入离心管后于37度恒温振荡水浴锅中负载30-40 MIN (注意避光),没有就放培养箱中,过十分钟拿出来震荡一下,但负载可能不均.

2.Fura-2/am虽然挺贵!但过期就不要用了,管它啥现象,
仅供参考!
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-6-26 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢斑竹的关照

加入血清应该不会对测定产生影响吧

我的染料是上界留下的
用DMSO溶解的原液,一直储存在-20度下
也不知是否过期了,但是380nm处的荧光还是很强的
负载细胞悬液后也一直在380处有最大激发波长
我加入tritionX-100后还是在380,实在是想不通
按理应该说细胞膜打破后,胞浆酶外泄
fura-2/am被分解,然后大量的胞内钙被结合
最大激发波长应该跃迁到340nm处啊
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-6-26 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wu11998866 于 2012-6-26 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

感谢斑竹的关照

加入血清应该不会对测定产生影响吧

我的染料是上界留下的
用DMSO溶解的原液,一直储存在-20度下
也不知是否过期了,但是380nm处的荧光还是很强的
负载细胞悬液后也一直在380处有最大激发波长
我加入 ...

1. 负载后还要用HBSS洗，没见血清有影响
2. 波长也跟仪器有关，不要认为文献上说波长是多少就多少，建议多试几个波长，加入tritionX-100后出现上限才对

你把步骤写详细点再发上来吧，让大家一块分析分析
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-6-26 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Ca2+荧光探针负载
原液配置(1 mg Fura 2-AM in 1 ml DMSO)
工作液配置（含0.2%牛血清白蛋白pbs稀释原液1000倍；现用现配）
1. 细胞沉淀用适量的工作液吹悬；避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以pbs液清洗一次，洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i
Fura-2的荧光强度测定用日立F-4500型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用比色杯中，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为Rmax；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为Rmin。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-6-26 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

又做了一次
负载后一离心感觉细胞没有了
另外,测定最大激发波长是在360nm附近,有些不正常.
然后也进行了钙离子浓度测定
出来的数据很不稳定,波动很大
我做的是酶法急性分离的大鼠心肌细胞
有过成功经验的朋友
请多指教
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发表于 2012-6-26 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

FURA-2测Ca 受多因素干扰
换：终浓度0.5% Triton试试

另外确定仪器没有问题
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-6-26 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是的
感觉现在很少有人用这种方法了
大部分都用激光共聚焦,膜片钳技术

感觉测定过程中数据的波动范围太大了
120--300
实在是不可思议
感觉应该是细胞质量不高
特别是到最后离心下来基本上没有看不到细胞了
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 小中大

测 细胞悬液 当然还是FURA-2/AM，聚焦： 单个细胞动态观察更好一些，是这样吧
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 小中大
看了大家的讨论，我也来说两句吧！
1、如果负载效果不好可以加入0.1％F127,负载应该没有问题。试试吧！
2、前面有位同志提出加0.2％BSA，这只是防止探针外漏！
3、细胞数量最好在10-5次方个。
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