细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助两个基因的共转染，筛了单克隆想得到稳定表达株...

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 18  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助两个基因的共转染，筛了单克隆想得到稳定表达株...

gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
1

发表于 2012-6-27 12:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助两个基因的共转染，筛了单克隆想得到稳定表达株...


我用pEBG载体和一个基因构建的一个质粒与HA-pcDNA3质粒共转染细胞，用的是lipofectamine 2000，lipofectamin TM+PLUS也用过，用G418筛选。转染的细胞我试过HeLa、PC3、MDA231、293T。
转染在6孔板中进行，转染5小时后换含血清的培养基，然后第二天再换液，有的时候会出现死亡的细胞比较多的情况。隔一天之后按1：3传代，然后再隔一天加G418筛选。等到绝大多数细胞死亡，6孔板中有细胞团出现的时候，把这些细胞团挑到96孔板里培养，然后扩大培养检测表达情况。可是我遇到了以下一些问题：
1、HeLa和PC3的克隆是长出来了，但是检测了几十个都没有表达。
2、293T的pool中可以检测到很低的表达，但是G418加到1000了还是没办法把单克隆筛出来，细胞就是不死，传了几代之后原来可以检测到的pool也检测不到了。
3、MDA的克隆很难长，并且会突然大批地死亡，有时候一个孔的细胞会在24小时之内突然全部死亡。

我这样筛选共转染的克隆成功的几率是不是很小？有没有什么好的改进办法呢？
顶部
bohe221[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74583
精华 0
积分 419
帖子 457
信誉分 100
可用分 3228
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
2

发表于 2012-6-27 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提取的质粒一定要纯。用G418初步筛选后，可以用有限稀释法试一试。
呵呵！
顶部
gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
3

发表于 2012-6-27 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

质粒不纯的后果是什么呢？容易导致细胞死亡吗？
顶部
gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
4

发表于 2012-6-27 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外想问一下，有没有既有neo抗性又有GSTtag 的载体呢？用于真核表达的那种。这样我就不用共转染了。
顶部
gmjghh[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75184
精华 0
积分 475
帖子 589
信誉分 100
可用分 3823
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5

发表于 2012-6-27 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先纠正楼主实验设计的一个错误：293T细胞本身就一个用G418筛选出来的细胞株（为了stable transfect T antigen），所以不应该再用G418来筛选的，加了G418之后293T当然是不死的了。

对于共转染挑稳定株，我的经验是除非你的细胞转染效率大于50％（以转GFP来估计效率）才考虑，如果转染效率本来就低，那就悬了。
你也可以用以下的方法先试验一下你的细胞是否能通过共转挑到稳定株：
共转10份的GFP质粒和1份的抗性质粒（neo或puro等，但是当然应该是GFP质粒中不带有的那种抗性啦），转染一天后1比6或更高的比例传代，加入筛选药物，看过几天后是否能看到绿色的克隆形成，如果最后发现长出来的克隆都是不是绿色，那估计是无法用共转来拿稳定株了，反之那还可能有戏。

对转染的建议：
1。转染的时候细胞一直都可以用带血清的培养基培养的，只要你配制DNA－Lipo时用无血清无抗生素的培养基就可以了，这样细胞状态会更好，转染效率会更高。
2。再摸一摸Hela和PC3的G418耐受浓度。
顶部
bananapeople[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75315
精华 1
积分 492
帖子 620
信誉分 102
可用分 3964
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态 离线
6

发表于 2012-6-27 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

暂时我还没有找到！不纯的话，影响转染效率。
细胞可能也有影响的！
顶部
bananapeople[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75315
精华 1
积分 492
帖子 620
信誉分 102
可用分 3964
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态 离线
7

发表于 2012-6-27 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果实在不能共转，又没有找到你要的“GST－Neo”质粒，建议你自己把GST通过PCR的方法加到你的目标基因前面或后面构建出来吧，也不难的，再克隆到pcDNA上面去吧。
偶觉得即便这样可能也比共转来的容易。
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
8

发表于 2012-6-27 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做转染,不过是悬浮细胞的稳定转染,转完48小时后1:2传代加G418,但细胞长的好快,很密很密,可是培养基颜色又没有太大的变化,我想请问这样下去转进去的细胞多么?
顶部
gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
9

发表于 2012-6-27 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的各位！
293T的问题我是曾经怀疑过的，因为是和别人要的细胞，但是问了人家之后他们也不是很清楚，这下总算明白了～

我的目的基因大概60多KD，再加上GST，然后再克隆到pcDNA上之后会不会太大了？大小对转染效率是有影响的吧？
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
10

发表于 2012-6-27 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GST也才26KD，换言之整个融合蛋白才不到100KD，还算比较常见吧，我们实验室做的膜蛋白一般都是120KD以上的，还是没有问题的。
不过，为什么会要做GST的真核表达呢？其他Tag不行么？融合了GST后倒是要担心对你的目标蛋白的功能有没有影响了，毕竟这么大的一个东西啊。我们加了Myc，FLag之类的Tag都还担心呢。
顶部
 18  1/2 12››