小中大[求助]前天复苏的成骨细胞系失败了，请教一些问题
我是第一次做细胞方面的实验，所有的东西都是自己准备的。包括瓶子的清洗、灭菌，DMEM培养基的配制、灭菌，细胞复苏等全过程，都是我独立完成，可是没有得到预期的结果，现把自己的准备过程写出，请专家们帮忙指点迷津：
1、盛放DMEM培养基玻璃瓶的清洗：洗涤灵浸泡过夜，试管刷刷洗，自来水冲洗，去离子水洗三次后，放烘箱中烘干待灭菌。
2、盛放DMEM培养基玻璃瓶的灭菌：将螺旋盖旋松，套上牛皮纸，放入高压灭菌锅中121Pa 20min。
3、蔡式滤器灭菌：将滤器拆开，用洗涤灵清洗后，烘箱烘干；将拆开的滤器用布包裹，高压灭菌：121Pa 20min。
4、DMEM培养基制备：放600ml蒸馏水（一蒸水）于1000ml大烧杯中，将DMEM粉末倒入烧杯，用玻璃棒搅拌，使其溶解；注入1000ml容量瓶中定容，待过滤。注：我们没有调节PH值（实验室师兄有做过，说不必调）
5、DMEM培养基灭菌：将灭菌好的蔡式滤器放入超经工作台中，安装上微滤膜0.22，准备过滤；将容量瓶中的培养基小心的倒入滤器中，加压，滤液流出；开始的部分滤液扔弃。
6、我们的血清没有灭活（根据前人经验），加入了双抗。（在用培养基之前加入）
7、从液氮中取出细胞系，快速放入37度水中，融化后，酒精擦拭表面，立即放入超静工作台，待转移入培养瓶。（我们的细胞未离心处理）
8、细胞悬液转移至培养瓶中后，加入5ml培养基，放入二氧化碳培养箱中培养。
9、一天后观察，细胞全部死亡
