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标题:[求助]mtt的od值偏低！

plaa[使用道具]
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发表于 2012-6-27 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]mtt的od值偏低！


我是用mtt来绘制贴壁细胞的生长曲线。
5x10(3)密度接种，培养10天，每天测一次。
开始几天板子的颜色很浅，最后细胞长满了班子的颜色也很深。
我用双波长（主570参630）测出的od值在0.03-0.3之间。
空白对照孔0.015左右。
看了不少mtt的帖子，好像大家一般认为0.3一下太低了。
我看书上说96孔板一个孔一般长满需要细胞1x10(5)。按我的接种密度，细胞数量前后差20倍左右。我的od值减去空白孔后前后差别差不多也是20倍。
很多人说用双波长就不用设空白对照，可是为什么我的空白对照值这么大？
我的值到底能不能用啊？为什么会这么低？
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发表于 2012-6-27 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该有问题，看你的步骤，我首先怀疑你的细胞在培养十天的过程中是否因为营养液的消耗基本死亡，但你说“按我的接种密度，细胞数量前后差20倍左右。我的od值减去空白孔后前后差别差不多也是20倍”。我不是十分明白你的意思。此外，假如你能确定你的细胞没问题的话，我建议你看看MTT是否失效。另外注意你MTT孵育4h后你是怎么去处上清的，是否因为这步将结晶损失了。我想到的暂时只有这些，祝你好运！
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发表于 2012-6-27 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以5x10(3)的密度接种，一个孔一般长满需要细胞1x10(5)。也就是说十天后细胞数量增值了20倍。（第10天的od减去空白对照od所得的值）除以（第一天的od减去空白对照的od）相差也是20倍。
空白对照孔只是没有接种细胞，其他的操作与接种细胞孔一样，od一般为0.015左右。那些未作任何处理的空白孔od一般为-0.013左右。
我在十天当中每3-4天换液一次，镜下看细胞生长良好。
MTT孵育4h后用移液器轻轻吸除余液，再在镜下可以看到一个个细胞变成“黑刺猬”似的。

我用DMSO，震荡十分钟后，细胞长满的孔颜色也挺深的！

如果用现在的od值绘制生长曲线，曲线的形态也还可以，只是od好像太小了！
我看有人的帖子说用10（6）级别密度接种细胞（悬浮细胞），也就是比我的细胞长满的数量还高10倍，od也就2-3。
用双波长大家贴壁细胞的od一般是多少？
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发表于 2012-6-27 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的方法和你的一样，但是要具体看是什么细胞了，
不同细胞的OD值差异很大的，一般正常细胞的高一些，E12的细胞1万的密度OD值在0.5-0.6的样子，Hs68（正常上皮纤维细胞）一般都可以达到1.1-1.2，肿瘤细胞2万的接种密度一般OD值在0.8-1.0的样子（我做过4种肿瘤的细胞，其中一种悬浮，悬浮的稍微高一点），这些都在接种后2-3天测的数据。所以具体要看你的细胞，还有加的试剂的浓度和量，DMSO请问你加了多少？还有MTT的浓度和量
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kswl870[使用道具]
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发表于 2012-6-27 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

贴壁细胞我阴性对照即正常状态的细胞一般在2左右，最低的碰到过0.8的，你的也太低了，还是怀疑你的细胞密度问题。有个极端情况就是你的酶标仪坏了^_^。
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发表于 2012-6-27 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的同志你是用的双波长吗？你的接种密度是多少？
10天时我在镜下看细胞已经长满了！
我们实验室其他做悬浮细胞的人数据也还好，应该不会是酶标仪坏了。
难道是我的试剂问题！要疯掉了！
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kswl870[使用道具]
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发表于 2012-6-27 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是570、630双波长测的，接种密度在5×10的四次方，在第四天测的数据。中途换液一次。DMSO我加200ul，MTT我加10ul。
顺便问下，你不会是加完DMSO就直接去读数的吧！！
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plaa[使用道具]
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发表于 2012-6-27 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我MTT加20ul，DMSO加150ul
加DMSO后震荡10分钟
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kswl870[使用道具]
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发表于 2012-6-27 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，我给以下建议：
1.加完DMSO后，遮光静置30min，震荡时间倒没必要这么长，30s足够了。
2.找个熟悉酶标仪的人帮你看看酶标仪的设置是否有问题。
3.可以去查下相关文献，看你做的细胞别人的相关数据。
4.重新做下实验，看数据是否还是那样。
5.假如数据依然一样，建议更换试剂。
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plaa[使用道具]
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 小中大

谢谢你的建议
还想问一下楼上的同志，你的空白对照孔和空白孔的od值是多少？
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