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标题:[求助]G418筛选细胞后的抗性克隆如何大量扩增

xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]G418筛选细胞后的抗性克隆如何大量扩增



各位师兄师姐好,我构建了真核表达载体用脂质体转染宫颈癌细胞后,是瞬时转染的,需要用G418筛选稳定细胞株,有了抗性克隆后如何让它大量扩增呢?我筛的细胞有了克隆后死活不长了真急死人了,希望各位大侠多多指教,谢谢
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nn255[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
获得抗性克隆后应该适当繁殖扩增冻存再进行单克隆化的操作。具体操作如果此时抗性克隆生长在96孔板中，待克隆长至一定大后，可先转入24孔板一个孔内，然后依次6孔板，细胞瓶逐级放大，效果会比较好。还有因为较小的抗性克隆比较脆弱，所以消化传代放大的时候操作一定要轻柔，刚转过来可以先不加抗性，待细胞贴壁后24小时再补加上抗性。另外，可以留一些细胞生长过的培养基再培养，因为毕竟是它熟悉的环境，有细胞因子什么的，只要保证营养充足，细胞容易适应。

先想起这么多。多多交流！
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nn255[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在24孔板筛的转至6孔板荧光消失是正常现象啊，因为你此时的抗性克隆肯定是多克隆，生长时野生型的有优势，或者说已转入的质粒由于整合在细胞染色体上的位置不合适也会外排的。

至于换液的问题，在筛选初期细胞大量死亡的时候肯定要及时换液，因为死细胞的内溶物对活细胞是有影响的。这时换掉的培养基是不能用的。但后期，没有细胞大量死亡时培养细胞时间也不长，或者说细胞长的很慢对培养基的营养消耗较少，这时扩大培养就可以适当加入旧培养基，也就能达到上述所说的目的了。

多多交流！
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的解答,那荧光消失是否就意味着我筛的细胞已经突变了,已经不是我想要的细胞了,那我是不是还的重新筛选呢?
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S6044[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人最近也在做这方面的工作，刚好沟通一下，请问你用的是哪种转染试剂？感觉效果怎么样？有没有出现转染之后第二天就有大量细胞死亡呢？我现在刚挑完筛选克隆，很头疼的是克隆在一边长一边死。
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发表于 2012-6-28 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是LipofectamineTM 2000,INVITROGEN公司的,感觉效果还行,只有一次在孔版转时第二天死了很多,别的次都挺好的,你的克隆是挑出来的还是传代的?
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windy+++[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的克隆是如何挑的呢?
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

You shouldn't scale up cells immediately once upon the positive cell clones emerge in medium with drugs if you are planning to establish stable cell line. You need to isolate your cell clones then screen to acquire clones expressing target protein.
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vera+[使用道具]
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发表于 2012-6-28 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位群友们,好!我最近也作细胞转染,用的是G418筛选
但是我在确定G418最低筛选浓度时遇到了一点问题,请各位战友指点
我用的是未转染的肿瘤细胞,24孔板,1000Cell／ml每孔，用药浓度分别是100μg/ml，200μg/ml,300μg/ml,400μg/ml,500μg/ml,............1100μg/ml.但是我发现在加药第四天后我的细胞除了100μg/ml那组还有少量细胞,其他孔已经全死了
而未加药的那组细胞生长良好
所以我想请教各位战友,是不是我理解错误,确定筛选浓度到底是用未转染的细胞还是用已经转染好的含有抗性的细胞
如果我没有理解错,我的遇到这种情况应该怎么办
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windy+++[使用道具]
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 小中大

我是用未转染细胞确定的筛选浓度,我也用过你说的稀释法筛细胞结果细胞也是死的不行,后来我在24孔板张到80 percent 汇合时筛的,多交流
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