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标题:[求助]含有SV40 origin的质粒能否在CHO细胞中复制？

kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]含有SV40 origin的质粒能否在CHO细胞中复制？


欲用一含EFGP的质粒表达目标蛋白，该质粒的说明书中写含有SV40 origin，可以在表达SV40 T抗原的哺乳动物细胞中进行复制，查了一下，COS-7中是可以表达这个抗原的，但我们实验室有的宿主细胞是CHO，上ATCC查了一下CHO的资料，似乎没有提到过这个SV40 T抗原，不知这个质粒能否在CHO细胞中复制？恳请各位高人指点，在线等！
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以的,但连接时要注意读码框, 比如对于PEGFP-N1,如果用HIND3做后面3'引物酶切点,就要在3'引物酶切位点后补加一个碱基,如果不加就表达不出绿色荧光.
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有大T抗原，不可以复制，只能瞬时表达
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢提醒！您以前做过吗？如果有相关经验的话可不可以告诉我您用的质粒是哪种？CHO是悬浮还是贴壁？
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从道理上讲我也这么认为的，不过我们实验室里大家的意见都很不致，所以还是在这里发贴求助了，不知您是否做过这方便的实验，有什么经验吗？期待您的答复！
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们一直在用CHO细胞作表达，不知道楼主想表达多少量的目的蛋白？

准确说来，蛋白表达首先取决于你的质粒是不是真核表达质粒

如果是真核表达质粒，你的质粒在CHO里面能瞬时表达，也能达到一定的量，但质粒肯定不能复制，所以蛋白表达量较低，传代以后不能就更低了

但你的质粒有可能整合到CHO细胞的基因组，如果你进行一定的筛选的话，有可能得到表达株
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的质粒是真核表达质粒，pEGFP -N1和pcDNA3.1(+)，希望得到的蛋白量最好能多一些，因为我的目的就是做表达及进一步抗体制备，以及蛋白本身的一些作用机制（原核换了一些宿主菌和载体，都没有表达成功，我们实验室真核表达没有经验）。基础薄弱，我不知道质粒整合到基因组这一点，不知这样的几率有多大？筛选如何进行？用贴壁的还是悬浮的宿主细胞比较好？呵呵，提这么多问题很麻烦您，我也自己去查些相关资料，再次感谢！
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glass[使用道具]
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发表于 2012-6-30 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最好确定一下你需要的蛋白表达量，看看下一步采取什么样的步骤

稳定株表达量稳定，但费时费事费力

稳定株的筛选用贴壁细胞比较好
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