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标题:[求助]请问哪位有成功的肺微血管原代培养的方法

junjie05[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请问哪位有成功的肺微血管原代培养的方法



大家好，我现在在养这种细胞。虽然有关细胞培养方面的文献也比较多，但是这种细胞不好养，养了好几个月，但是不见什么起色。我知道园子里有很多这方面的高手，敬请各位赐教！如果哪位有成功的方法，请介绍一下成功的经验吧！多谢！
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说说你的培养细节:具体步骤，使用液体，等等。要不大伙没法帮你分析原因。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的，谢谢楼上，我把我的方法说说：培养基是DMEM(20%FBS,双抗，肝素）
具体步骤：
断头处死大鼠，取肺周组织，PBS漂洗2次。眼科剪尽量剪碎。贴组织块，加入培养基，8小时翻转，72小时去组织块。继续培养大概一周后传代。


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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
操作没问题，72h稍微长了点，会有成纤维细胞爬出，60h比较好．
从你的图片看，原代已有内皮细胞爬出，估计你现在的困难是细胞难以维持及传代.
你的问题是培养液不对. DMEM+FBS是不可能养出血管内皮细胞的（估计你这个方法是参考文献而来，hoho，这样的话，咱们走过的路是一样的.最后才明白:尽信书不如无书）.
最好使用微血管专用培养基，cascade biologics公司有售. 可能价格较高，但是养内皮细胞不化大钱是很难成功的.

good luck.
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上面的战友说的极是，我觉得我能得到内皮细胞，但是传代后就不行了。我现在改用了RPMI1640了，不知行不行？我这还有照片，求鉴定！看看是不是内皮细胞？感觉像内皮细胞（没有传代的）


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2012-6-30 13:06
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发表于 2012-6-30 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有就是传代怎样才能做到内皮细胞的纯化？我觉得成纤维和上皮细胞很容易干扰，请大伙给点意见，谢谢大家！
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 内皮细胞必须用专用培养基这个是毫无疑问的，现在你的状况已经用事实证明了这一点. 专用液体必须化大钱.

2 成纤维细胞的去除，可以用机械刮除，克隆筛选等，但是效率不高.

3 如果想在短时间内获得大量纯化细胞，可以用胶原酶消化肺组织获得单细胞悬液，然后用CD31标记的磁珠筛选即可. 好像Gibco有专用试剂盒. 不过价钱肯定很高.

总之一句话，不下苦工，不化大钱不可能养成内皮细胞，那些所谓内皮细胞好养的人，要么养的是细胞系，要么养出的根本就不是内皮细胞，相信你已经有这种体会了.

祝愿实验成功，一切顺利!
GOOD LUCK!!!
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

文献上和园子里有用MCDB131和human endothelial SFM的，我想请问一下，这两种培养基哪种更好
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
文献上有用MCDB131和human endothelial SFM的，我想请问一下，这两种培养基哪种更好

—————————————————————————————

都不如cascade biologics公司微血管内皮细胞专用培养基.
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-6-30 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我觉得原代能够养出来，但是杂细胞比较多，但是传代以后，细胞就感觉不行了，形态就像一层薄膜一样，是不是细胞已经死了？为什么这样，请战友解释一下，如果换培养有没有改进，ECGF作用大不大，需不需要加？
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