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标题:[求助]髁突软骨细胞原代培养具体操作和注意事项

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]髁突软骨细胞原代培养具体操作和注意事项


操作了一次　　　今天看贴上的细胞少的可怜　　　组织快也在晃
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loli[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有关系,原代的软骨细胞生长比较慢的,我目前正在做关节软骨的培养,20天.才看见瓶底有铺路石样的集落,
我的经验
1,软骨细胞无菌取下后，用胶原酶消化4－5小时，离心后接在细胞瓶或细胞板中，但细胞板容易生长，细胞瓶用0.1％的明胶先铺一下。但我感觉细胞板生长好一点，容易贴壁。
2 培养液不要太多，瓶底能覆盖就可以了
3 一般3天内，我不去动他，没有关系，观察细胞培养液，三天如果变黄了换液，不黄可以再放几天。细胞会长起来的。发张照片看看吧，传代以后细胞生长良好，2－3天就铺满瓶底。


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2012-7-3 15:30
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

完全同意楼上的说法。
建议∶现在把细胞放回培养箱，去干别的事吧，到周末再看看，说不定有惊喜哟。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充一下，照片是原代培养20天的照片100倍
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join[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢两位
今天是第16天了 还是没有多的进展 帖壁细胞没有一点增多
我对第一次取的不抱有什么希望了 今天还是看了一次 进几天 出现了新的现象
不知道是不是污染现象 附有图片


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summerxx[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的原代是没有过滤的(看到的那团块状是组织) ,,现在看到的那些长短不一的短条状 我很担心是杂菌
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summerxx[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我还有些 想不太清楚的问题 肯请指教
1 取原代组织快培养是时多放点培养液有什么不可吗 ,是影响帖壁速度吗
2一次性培养 瓶在孵化时不应该拧的很紧吗(真的可以内外保持相通)
3为什么有时说消化时(本来是恒温的摇床) 可以放在孵箱短暂孵化几分种
4对于我的软骨原代孵化 组织快有留下一起孵化的必要吗
5原代细胞很难做到取材纯净 有如何比较好的纯化方法吗(是反复贴壁吗)
6原代的台盼蓝检测 意义何在
谢谢
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发表于 2012-7-3 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从个人经验试着回答，高手们不要见笑:
Q 1 取原代组织快培养是时多放点培养液有什么不可吗 ,是影响帖壁速度吗
A: 原代是培养液尽可能小一些，利于细胞贴壁. 培养液多了害多益少.

Ｑ 2一次性培养 瓶在孵化时不应该拧的很紧吗(真的可以内外保持相通)
A: 如果你的瓶盖有滤膜，拧紧没问题. 如果没滤膜，拧紧就不对啦.

Q 3为什么有时说消化时(本来是恒温的摇床) 可以放在孵箱短暂孵化几分种
A:主要是让消化液进入组治内，必要性不大.

Q 4对于我的软骨原代孵化 组织快有留下一起孵化的必要吗
A: 很有必要.

Q 5原代细胞很难做到取材纯净 有如何比较好的纯化方法吗(是反复贴壁吗)
A:据我所知的最有效方法，就是取材时尽量做到取材纯净.

Q 6原代的台盼蓝检测 意义何在
A: 理论上可以检测活细胞数量，实际上原代培养时做此检测意义不大.

GOOD LUCK!!!

PS:你的照片质量太差. 一定要重视照片质量.否则再好的实验结果也会大打折扣.
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外.
把你的操作及使用试剂尽量详细的列出来，大家帮你看看有什么问题.
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-7-3 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是我的第二次经历 结果不尽人意

一 用品
1 动物 新西兰兔6只(2周)
2 试剂 DMEM培养基(高糖型)--胎牛血清 0.25%胰蛋白酶 0.1%胶原酶--II PBS溶液(含双抗)
3 培养皿 5ml吸管 离心管 解剖用具 磁力搅拌器 25ml培养瓶 200目不锈钢筛网
二 步骤
1 取兔,断颈,备皮(碘酒,酒精),剥离皮肤, 无菌条件下切取双侧髁突,以含双抗(含青霉素100ui/ml ,链霉素100ug/ml 的PBS溶液) PBS 冲洗三次,并剥离软骨,放入小瓶中,剪成1mm3的小组织块.(在不含FCS的培养液中进行,持续约2小时)

2 加入0.25%的胰蛋白酶5ml (约20倍体积),在37C水浴中磁棒震荡.消化60min(见组织疏松为止) .轻轻吹打,自然下沉,将胰酶消化后的悬浊液倒入离心管, 以1000r/min 离心5min.弃上清.
3 加入0.1%的胶原酶--II 5ml(约20倍体积),在37C的水浴中震荡下消化 4h(此期间定时在镜下观察,见大量单个细胞游离出来 即终止) .(并无经验).
4加入DMEM-FBS培养基(同时也终止了消化 ? ),吸管反复吹打,分散细胞,以1000r/min 离5min,获取细胞团(包含组织块).将获得的软骨细胞重悬浮于10%胎牛血清的DMEM培养液中制成细胞悬液.
5 将细胞悬浮液接种于25ml 培养瓶中,加入8mlDMEM完全培养液,置于5% CO2孵箱, 在37C,5% 饱和湿度下培养.2天观察.见细胞大量散在帖壁.
但约5天开始出现细胞死亡 ,接着开始广泛死亡.(老师说胞膜出现破裂)培养液清澈,颜色无变化

疑问 组织块要过滤掉吗 在接种后是否应帖壁
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