小中大[求助]血管内皮细胞养不活，如何办？
各位同行，大家好！我计划从大鼠的坐骨神经上面取得微血管内皮细胞进行原代培养，可是总不成功，也不知道原因何在？希望有同行能够给一些指点！具体步骤如下：
1、无菌取出一只大鼠两侧坐骨神经，放置于D-hanks液中，周围用冰保持低温，送至超净台内，用D-hanks液尽可能洗去血迹。
2、加入含0.015微克/mlDNA酶的D-hanks液吹洗神经2分钟左右，分解神经外膜，吸出洗液。再加入含0.015微克/mlDNA酶、0.025%胰蛋白酶和0.05%胶原酶的D-hanks液，使用眼科剪在此液中将神经剪为1mm3大小的碎块，放入36.5度、5%CO2温箱中2小时以获得脱落细胞。
3、到达时间点后使其通过一个70微米的细胞滤过器，除去组织块。将滤过的液体1650转离心4分钟，倒掉上清液。加入培养液（10%FCS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、1%左旋谷酰胺以及1%肝素钠，培养基是F12，购于Hyclone）吹打混匀后同等条件再度离心，弃去上清。
4、再加入上述培养液吹打混匀移入培养瓶中，36.5度、5%CO2孵育，4小时后换培养液2/3。以后2-3天换液一次。
