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标题:[求助]有人做过MDCK细胞的转染吗？

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-7-3 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]有人做过MDCK细胞的转染吗？


有无在MDCK细胞上做siRNA转染的？效果如何？
我们用带绿色荧光基因的单质粒转染MDCK细胞，转染效率极低，几乎看不到荧光，而对照的293T转染效率几乎是100％。如果按照这样的转染效率，几乎没有办法转染化学合成的siRNA。
有无做过类似实验的？请进来谈谈。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-7-3 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不会吧，据试剂公司称，MDCK属于容易转染的细胞啊。以下是UpState公司产品说明的一部分文字：

Upstate - Support - Protocols - siIMPORTER Transfection Protocol

The siIMPORTER™ siRNA Transfection Reagent should be stored at 4 C and never frozen. ... Some cell types such as HeLa, MDCK and CHO-K1 may result in higher transfection efficiencies if serum is not present in the transfection for the ...
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-7-3 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不知道这个公司的试剂有何优点。
在流感病毒的反向遗传学系统中，苦于MDCK细胞的低转染效率，国际上都是采用了先转染293T包装成假病毒，尔后再将该假病毒接种MDCK细胞。
在我们的实践经验中，MDCK特别难转染。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-7-3 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过脂质体的转染效率还行。不知道你用的什么试剂？


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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-7-3 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再看一下我们自己的转染试剂的结果。还有不是DNA的转染效果不好，siRNA就不好。比如A549细胞用脂质体转染的DNA效果不好但是siRNA的可以达到80％左右，用x-tremegene可以到90％左右。


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发表于 2012-7-3 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用LF2000和Trans－IT，转染MDCK，效果都非常差。几乎看不到楼上的那样效果。楼上荧光的是A549细胞还是MDCK细胞？

能否将你们转染MDCK细胞的步骤简述一下？MDCK细胞长得特别快，种到96孔板一会，就很快贴壁 了。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-7-3 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

荧光照片都是MDCK的。第一张是用脂质体转染的，第二张是我们自己开发的转染试剂做的。转的都是增强型绿色荧光蛋白质粒。我们通常用的是24孔板，转染前一天种细胞，我们细胞没有计数，都是按面积的。一般情况第二天要细胞达到80%左右。密度低的话转染试剂的毒性较明显，密度高的话不利于转染。以脂质体为例的话，步骤都差不多，先配质粒后配脂质体这样可以保证5min内的混合。注意转染时要用无抗生素的培养基。转染后6小时最好要换液，可以降低脂质体的毒性。
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发表于 2012-7-3 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上是按照怎样的比例接种细胞的？细胞长满单层后，稀释多少铺板？

一般siRNA转染，都要求细胞密度在30~50％左右。但是细胞毒性非常明显！我用Qiagen的Hipefect、LF2000等都看到明显的细胞毒性。
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发表于 2012-7-3 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

举例说吧：六孔板的每个孔面积是10cm2，六个孔就是60cm2，我们通常用60cm2的三分之一也就是20cm2来作为需要的量。也就是说一个长到80％左右的20cm2培养皿正好可以铺一个六孔板，并且铺的细胞的密度大致是30％左右。但是这个也要根据细胞生长速度来进一步调整，因为不同细胞的生长周期不同，周期短的要铺稍微少一些，周期长的就要多一些。只有调整后才能保证24小时后是你需要的50～60％。
个人认为siRNA的转染在50～60％最好，低的话毒性明显，高的话转染效率会下降。
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-7-3 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人认为siRNA的转染在50～60％最好，低的话毒性明显，高的话转染效率会下降。

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的确如此。我现在就为此头疼。我将siRNA转染后，还需要感染病毒。但是细胞状态不好，对病毒的噬性就改变了。
楼上评价siRNA转染的效率使用什么方法？如果是shRNA，可以用GFP质粒观察；化学合成的siRNA，其转染效率如何判定？
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