细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]如何收获病毒？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]如何收获病毒？

@STAR@[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74483
精华 0
积分 464
帖子 506
信誉分 101
可用分 3456
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
1

发表于 2012-7-3 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何收获病毒？


请教一下战友们细胞培养的病毒收获病毒时,是直接将培养瓶拿去反复冻融后收获?还是将细胞消化离心下来重悬后再反复冻融收获呢?
顶部
BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
2

发表于 2012-7-3 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

后者将细胞消化离心下来重悬后再反复冻融收获
顶部
daod[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76758
精华 0
积分 585
帖子 790
信誉分 100
可用分 4891
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
3

发表于 2012-7-3 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教斑竹，为什么是后者呢？
我在做的时候是冻融三次后收集悬液，离心后取上清分装保存。我认为反复冻融可破坏细胞壁，使病毒释放出来，而离心后病毒即存在于上清中。为什么还需消化离心重悬呢？
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
4

发表于 2012-7-3 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主说的两种方法其实都可以。本人都试过。文献里说的一般是先把细胞刮下来，再冻融。不过这样有点麻烦。所以我就改成直接把接毒的细胞冻融三次，离心，取上清作为毒种保存。这样收获的病毒滴度可能会比前一种方式低一点。另外，我养的是sv40。
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
5

发表于 2012-7-3 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为后者可以将许多瓶细胞放在一起后加入少量液体后冻融来提高单位液体中的病毒滴度，不会使之很低。
顶部
@STAR@[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74483
精华 0
积分 464
帖子 506
信誉分 101
可用分 3456
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
6

发表于 2012-7-3 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢各位的回答!因为我想培养上清也可能含有病毒,只是量相对少.也不是要制备高浓度的病毒滴度,消化离心似乎多此一举,反而多了不必要的麻烦.而直接冻融又考虑到培养基中血清是否对以后病毒的保存会产生影响?
顶部
TAT[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74236
精华 0
积分 507
帖子 694
信誉分 100
可用分 4298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
7

发表于 2012-7-3 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正在做HSV方面的实验。
第一批收集的病毒，毒力太强，接种后第二天CPE非常明显，大部分脱壁了。用染料摄入法测出TCID50约为18，即半数细胞感染量约为10（-18）,考虑到下一步的每次实验都要将病毒反复稀释，非常麻烦，于是又将第一批收获的病毒种连续稀释了10倍，接种细胞后又收获了一批。结果接种后细胞病变很不明显，检测的数据结果很不理想。
第三批，我取了中间稀释5倍的病毒种又接种了一次，今天第二天，细胞病变++---+++，明后天应该可以收获病毒。
我前两次都是直接反复冻融后取上清离心后分装保存的病毒种。这种方法收集的滴度偏低是吗？我想改变一下收集方法。
“将细胞消化离心下来重悬后再反复冻融收获”
你所介绍的这种方法我没试过。简述一下你听听是否正确：
1。CPE+++---++++, 弃旧培养液，PBS清洗2－3次。
2。加胰酶消化，完培中止消化。
3。吹打脱壁，转移至离心管，离心。
4。弃上清，加维持液重悬。
5。反复冻融3次，离心，取上清分装保存。
对吗？还有疑问：
如果收获时细胞病变很明显，大部分细胞已经脱落形成空斑了，那么在消化之前PBS清洗，是否将被病毒感染死亡的细胞洗去了呢，这些细胞内不含有病毒吗？
“因为后者可以将许多瓶细胞放在一起后加入少量液体后冻融来提高单位液体中的病毒滴度，不会使之很低。”
如果大部分细胞已脱落，剩下少量残存的细胞，消化离心重悬后反复冻融，也只有这些细胞内的病毒能释放出来，即使加少量液体，病毒滴度会高吗？
我因为体外做完还有动物实验，所以尽量收集足够的病毒种，以便以后的实验都使用同一滴度的病毒，所以如果只加少量液体冻融，我担心量不够，加多了又担心滴度太低。
已经摸浓度摸了很久了，滴度测不出下面的实验都没法进行。所以特别愁。
请指点迷津，我下一步该如何收获？
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
8

发表于 2012-7-3 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"楼主说的两种方法其实都可以。本人都试过。文献里说的一般是先把细胞刮下来，再冻融。不过这样有点麻烦。所以我就改成直接把接毒的细胞冻融三次，离心，取上清作为毒种保存。这样收获的病毒滴度可能会比前一种方式低一点。另外，我养的是sv40。 "
请问是讲直接冻融收获的病毒滴度要比消化离心后重悬冻融收获的病毒滴度低吗?为什么呢?这似乎不太合理论呀.
再请教大家一个问题,因为细胞是带毒传代,病毒并不产生CPE,那么我要在不同细胞代数收获病毒进行实验,以说明病毒在不同细胞代次的增殖规律,我该如何收获不同代次的病毒呢?是同一瓶细胞部分收毒,部分继续传代?还是一次传两瓶细胞,一瓶收毒,一瓶传代呢?似乎两种方法都存在取材的不均一性.不知做过的战友你们是如何操作的呢?恳请赐教!
还有"染料摄入法测出TCID50"的原理及步骤是怎么样的呢?像那种在细胞上培养并不产生病变的病毒,是否可以用这种方法测TCID50呢?请指教!
顶部
any333[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 76446
精华 1
积分 1533
帖子 2542
信誉分 102
可用分 13711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
9

发表于 2012-7-3 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室有这样的方法（收获腺病毒）：
在细胞差不多都脱落下来的情况下，将残余细胞吹打下来，将瓶中培养基转入离心管中离心，吸取上清保存；留约200uL上清重悬沉淀，转入Ep管中反复冻融，再离心，合并上清。

因为没有测过，所以不知道第一次收获的上清滴度是不是较低，如果需要的话，可以做个实验，将两次获得的上清比较一下。
顶部
any333[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 76446
精华 1
积分 1533
帖子 2542
信誉分 102
可用分 13711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
10

发表于 2012-7-3 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室有这样的方法（收获腺病毒）：
在细胞差不多都脱落下来的情况下，将残余细胞吹打下来，将瓶中培养基转入离心管中离心，吸取上清保存；留约200uL上清重悬沉淀，转入Ep管中反复冻融，再离心，合并上清。

因为没有测过，所以不知道第一次收获的上清滴度是不是较低，如果需要的话，可以做个实验，将两次获得的上清比较一下。
顶部
 13  1/2 12››