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标题:[讨论帖]培养基配制

junhun[使用道具]
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发表于 2012-7-6 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[讨论帖]培养基配制


细胞版中经常看到培养基配制的求助，只要养细胞都会遇到配制培养基问题，特设专题讨论，请大家踊跃发言。
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小螺号[使用道具]
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发表于 2012-7-6 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室买的是袋装的粉剂，用上过泵的三蒸水配制，简单的步骤是
1 准备瓶子，胶塞，瓶子干烤，胶塞上泵消毒备用
2 配制培养基用的三蒸水上泵后，晾放至室温
溶解买来的培养基，DMEM,1640等，用hepes和碳酸氢钠调ph值
3 搅拌均匀，过滤
4－20度保存备用
呵呵，虽然很麻烦，可是比较省钱
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-7-6 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我配制的是1640，方法和楼上基本上一样，不过还加了10万单位的青霉素和链霉素！
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2012-7-6 11:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为了省事，我们实验室今年培养细胞所用培养液都是
购买的美国HYCLONE公司产的1640液体培养液，500毫升装
，在武汉的价格人民币60元一瓶。使用时直接加入50毫升
小牛血清、谷氨酰胺以及双抗，混匀。不用调PH就可使用了。
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milkdog[使用道具]
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发表于 2012-7-6 11:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GIBCO的低糖DMEM粉剂配制说明（普通高糖的DMEM培养基配法是一样的）：
TO PREPARE 1*LIQUID
1. Measrue out 5% less distilled water than desired total volume of medium using a
mixing container that is as close to the final volume as possible.
2. Add powdered medium to 15 to 30℃ (room temperature)water with gentle stirring.
(Do not heat water)
3. Rinse out inside of package to remove all traces of powder.
4. Add 3.7g of NaHCO3 per liter of medium.
5. Dilute to a desired volume with water. Stir until dissolved. (Do not over-mix)
6. Adjust pH of medium to 0.2-0.3 below desired final working pH* use of IN NaOH or
IN HCl is recommended. (Add slowly with stirring) After pH has been adjusted keep
container closed until medium is filtered.
7. Sterilize immediately by membrane filtration. (Positive pressure recommended)
*pH unite will usually rise 0.1-0.3upon filtration.
另外，在李玲、李雪峰编著的《细胞生物学实验》（湖南科学技术出版社）中配制方法如下：
1 制备新鲜三蒸水或Millipore超纯水。
2 称取所需量的干粉培养基，加入约终体积一半的三蒸水中；若配制一个包装的培养液，在将整个包装的干粉倒入三蒸水后，需用水洗包装袋内面2次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解。
3 根据包装袋上的要求补加所需量的碳酸氢钠；根据实验需要，添HEPES（5-20mmol/L）、谷氨酰胺和其他特殊物质。
4 加水定容到终体积。
5 必要时用1 mol/L 盐酸和1 mol/L 氢氧化钠调节pH。
6 用无菌0.22um滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中，4℃冰箱保存。
配制好的培养液用前加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，并根据需要加入血清（5%-20%）
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yysr238[使用道具]
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发表于 2012-7-6 11:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果培养基中需要添加HEPES，最好购买已经含有HEPES的干粉培养基。

在配方中不含HEPES的培养基中添加HEPES，会改变培养基的渗透压和离子平衡。
请大家仔细对比Invitrogen、Sigma、Hyclone、Applichem等各家公司提供的培养基配方，凡是已经加了HEPES的培养基，其中NaCl的量都少了很多，尤其是DMEM培养基，甚至从6.4g降低到4.4g。如果我们额外添加HEPES，无法降低NaCl用量，相当于离子浓度增加，会对细胞造成一些影响。

需要补充碳酸氢钠的培养基，要把培养基干粉和碳酸氢钠分别溶解后再混合，否则会影响干粉培养基中某些氨基酸的溶解。

调节培养基pH要用pH计，不能用精密pH试纸。因为pH试纸规定不适用于弱缓冲盐溶液，而培养基恰恰就属于弱的缓冲盐溶液，测不准确的。

目前Hyclone北京公司生产的常用培养基60元/500ml，非常实惠，用过之后还能留下那个美国进口Nalgene公司产的PET材质大方瓶子，盛电泳缓冲液之类的非常好。12月31日前Invitrogen公司的进口液体培养基65元/500ml，有加了HEPES的DMEM高糖，很超值。
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ero11[使用道具]
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 小中大
我们实验室配的GIBCO的低糖DMEM，步骤：
1 准备瓶子，瓶子洗净，泡酸过夜后干烤，胶塞，先用蒸馏水煮30分钟，晾干后上泵消毒备用
2 配制培养基用的三蒸水上泵半小时后，晾放至室温
溶解买来的培养基干粉，一袋配一升，加hepes2.38g和碳酸氢钠3.7g,之后用氢氧化钠或盐酸调ph值
3 搅拌均匀，过滤
4、4度保存备用
5同时配双抗，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，－20度保存用时加入培养基中。另配谷氨酰胺，2.922g加入100ml三蒸水中，分装2ml/瓶，－20度保存。用时融解，2ml加入200ml培养基中。这样可以减少污染机会
呵呵，用的感觉挺好的，希望为战友提供参考。
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pengke1983[使用道具]
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 小中大
下面是我收集GIBCO培养基的配制的操作过程
RPMI-1640(10.4g/pkg) TO PREPARE 1*LIQUID MEDIUM
1. Measrue out 5% less distilled water than desired total volume of medium using a
mixing container that is as close to the final volume as possible.
2. Add powdered medium to 15 to 30℃ (room temperature)water with gentle stirring.
(Do not heat water)
3. Rinse out inside of package to remove all traces of powder.
4. Add 2.0g of NaHCO3 per liter of medium.
5. Dilute to a desired volume with water. Stir until dissolved. (Do not over-mix)
6. Adjust pH of medium to 0.2-0.3 below desired final working pH* use of IN NaOH or
IN HCl is recommended. (Add slowly with stirring) After pH has been adjusted keep
container closed until medium is filtered.
7. Sterilize immediately by membrane filtration. (Positive pressure recommended)
*pH unite will usually rise 0.1-0.3upon filtration
以下培养基与RPMI-1640操作步骤基本相同，只是第4步不同
MEM(9.6g/pkg)
4.Add 2.2g of NaHco3 per liter of medium.
DMEM/F12(15.6g/pkg)
4.Add 1.2g of NaHco3 per liter of medium.
DMEM高糖(13.4g/pkg))
4.Add 3.7g of NaHco3 per liter of medium.
欢迎各位战友补充。另外请对以下问题讨论：
1.用醋酸还是HCL调PH值好
2.能否直接用NaHco3调PH值
3.配培养基时能否直接加双抗
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tangxin_80[使用道具]
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 小中大

我们实验室用的是GIBCO生产的Grace's insect cell culture，干粉，步骤：
1 准备干净的灭过菌的瓶子和胶塞。烧制双蒸水。
2 溶解培养基干粉，一瓶配一升，加水解乳蛋白3G和碳酸氢钠0.35g,之后用氢氧化钠或盐酸调ph值
3加双抗，20万单位的青霉素和链霉素各1mL，
4、搅拌均匀，过滤，4度保存
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cocacola[使用道具]
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发表于 2012-7-6 12:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
怎么确定所用的培养基需不需加hepes,如:1640养Lewis肺癌细胞需不需加hepes.还有上面有位楼主说用hepes和碳酸氢钠调ph值,为什么用hepes调ph值?
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