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标题:[求助]请问肺癌原代细胞培养如何分离成纤维细胞？

qhyu[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请问肺癌原代细胞培养如何分离成纤维细胞？



从植物转到动物细胞，就遇到大难题，利用胰酶消化时间差，＆贴壁时间差效果都不是很好，往往看着成纤维细胞很少了没几天又长很多，纯化后非癌细胞也少的可怜了。
请问有没有什么物质可以特意对成纤维细胞有毒性这样分离那？
希望各位师兄师姐能够指教
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KGZ564[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以考虑进行单克隆操作.
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发表于 2012-7-10 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有别的方法,只有根据贴壁时间的不同来进行纯化.
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qhyu[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家，
根据贴壁时间的不同来进行纯化的方法用过，不太好效果，原代细胞本身长得就慢，怕单克隆操作不行，试试再说
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summerxx[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近也在作原代上皮肿瘤培养， 遇到了和你一样的问题。 有人建议我用无血清培养基， 加上一些上皮细胞生长必需的因子 。 因为成纤维细胞在无血清的培养条件下无法生长。你不妨试试。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用D-valine培养基啊，一般的培养基都是L-valine培养基，而D-valine培养基中，成纤维细胞是会死掉的：只有含有右旋氨基酸氧化酶的细胞能够将右旋缬氨酸转化成为细胞生长必需的左旋缬氨酸，并在这种培养基中正常生长，否则不能生长。由于成纤维细胞无这种酶，所以在此培养基中逐渐死亡。具体的原理可以看看这个文章：Gilbert SF,Migeon BR.D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture［J］.Cell,1972,5: 11-17
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HPLC使者[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个文章是SD数据库中的：
D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture • ARTICLE
Cell, Volume 5, Issue 1, May 1975, Pages 11-17
Scott F. Gilbert and Barbara R. Migeon
Abstract | Abstract + References | PDF (12941 K)
但是太大了，下不了啊，下了几次都是端了。快13M了。我们的校园网搞不定啊。你看看你自己的学校的网能不能有这个全文啊。不行的话，到SOS求助去。谢谢。不好意思啊。
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milkdog[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是我查到的，楼主可参考
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
在肿瘤细胞中排除成纤维细胞，常采用五种方法，即机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。
1、机械刮除法
用不锈钢丝末端的橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插入不锈钢丝)或裹上少许脱脂棉制成，装入试管中高压蒸气灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。程序如下：
(1)标记 镜下观察，用记号笔在培养瓶(皿)的背面圈下肿瘤细胞的部位。
(2)刮除 弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶(皿)中，在肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记细胞空间。
(3)Hanks液冲洗1～2次，洗除被刮掉的细胞。
(4)加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至彻底刮净为止。
2、反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。方法如下(同贴壁传代)：
(1)待细胞生长达一定数量后，倒去旧液，用0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞悬液。
(2)取三个培养瓶分别编号为A、B、C，首先把细胞悬液接种入A瓶，置温箱中静置培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B瓶中，然后向A瓶中补充完全培养基置温箱继续培养。
(3)B瓶中的细胞静置培养5～20分钟后，按处理A瓶的方法，把B瓶中的培养液和细胞悬液吸出并注入C瓶中，再向B瓶补加完全培养基，C瓶补加少量小牛血清(浓度为10%)。
三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成功，次日观察，可见A瓶中主要为成纤维细胞，B瓶中两类细胞混杂，C瓶中主要为上皮细胞(癌细胞)，必要时可反复处理几次直至癌细胞纯化为止。
3、消化排除法
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体方法如下：
(1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新的混合液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立即停止消化。
(2)把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落，原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。
4、胶原酶消化法
本法是利用成纤维细胞对胶原较为敏感的特点，通过消化进行选择。
(1)可用0.5mg/mL的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后即终止消化。
(2)用Hanks液洗涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未清除净，可再次重复。
5、密度梯度离心法
用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.025～1.085的密度梯度分离液，加入细胞悬液后，2500r/min离心10分钟，在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重为1.065～1.085层为上皮细胞，将收集的上皮细胞经洗液3次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞。
最近，有人用SOD来抑制成纤维细胞的生长，这些方法都需进行预试验取得经验，找出适合条件，才能获得好结果。
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milkdog[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其中2，3两种方法我也试过，效果不是太好，不知道不同的细胞之间是否有差别，我做的是卵巢上皮细胞的原代培养。现在还在摸索中
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qhyu[使用道具]
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发表于 2012-7-10 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家
机械刮除需要细胞分得很开，可是我得两种细胞长在一起很难分开
这些天实验室搬家还不能做试验，过些天看效果了
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