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标题:[求助]雪旺细胞的原代培养问题

西子[使用道具]
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发表于 2012-7-10 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]雪旺细胞的原代培养问题


我在做犬的雪旺细胞的原代培养，查阅了相关文献，很多人建议用“0.25%胰酶和0.03%胶原酶II或胶原酶I混合消化90分钟”，也有建议先“用0.25%胰酶和0.2%胶原酶II或胶原酶I混合消化40-60分钟，再单纯用0.2%胶原酶II或胶原酶I消化60分钟”，
我按照要求将神经外膜剥离干净，把神经束抽出剪碎，但是用以上方法消化发现，经过90分钟混合消化后，组织成絮状，还是没有消化，我又用胶原酶单纯继续消化90分钟，结果，组织倒是不成絮状了，但还是成小颗粒块状，总共历时3个小时的消化时间，始终没有达到目的。
我做了3次，都是这个现象，请大家帮我分析下，是什么原因，是酶的选择问题还是浓度问题（我用的胶原酶II，没有用胶原酶I），要不是时间问题，还有，有些建议是“在37度水浴下消化“，有些建议“在37度培养箱里消化“，我选择的是后者，是不是这个问题导致的呢？
如果用组织块培养法的话，是不是效果好些呢。
我查阅很多关于雪旺细胞的原代培养的文章，都写的很轻松，30分钟，1个小时，最多90分钟就消化彻底了，真是彻底把我打击了！！！
请各位高手指点下吧，万分感谢！
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发表于 2012-7-10 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酶的消化受很多因素的影响，所以完全按文献做还是常常会得不到相同的结果。
你应该把关键的条件如溶液、PH、温度等告之。
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hyuu[使用道具]
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发表于 2012-7-10 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为培养SCs，主要有一下三个步骤：
(1)分离出培养雪旺细胞所需要的神经段并机械及酶消化去除神经外膜结缔组织等；
(2) 将神经段离心提取细胞成份进行初培养以纯化；
(3) 进行传代培养以扩增；
其中最关键是尽可能抑制成纤维细胞生长，可用Ara-C选择性抑制成纤维细胞的大量增殖。
下面是一个简单的方法，仅供参考：
取新生鼠坐骨神经去神经外膜剪成碎片后植于Ⅱ型胶原基质上，隔日更换胶原以减少成纤维细胞生长，数次后移入加有10%胎牛血清及100μg/ml 牛垂体提取物的DMEM 液中培养10d ，即可获得较多数量和较高纯度的SCs。
希望多少对你有所帮助，多摸索几次，通过不断改进，相信一定会成功！
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西子[使用道具]
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发表于 2012-7-10 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是做成年犬的雪旺细胞培养啊，楼上的朋友说的我也知道，但是困绕我目前的主要问题就是消化不彻底啊，我看有朋友说他用胶原酶消化6-8小时，天，是不是真的需要那么久啊，还有就是酶的用量、浓度和时间，请各位战友帮帮忙啊，多谢！多谢！
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fklo83[使用道具]
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发表于 2012-7-10 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的 是 成年兔坐骨神经雪旺细胞，消化还 可以，用的是胰酶20分钟和
一型胶原酶60分钟，但就是不 贴壁，不伸展，
请各位同人指教！
谢谢！
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发表于 2012-7-10 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在我以前培养神经干细胞过程中，消化胎鼠脑组织时，也遇到过这种情况，以前刚开始养神经干细胞的时候，反倒没有出现过这种情况。对比这两种情况，自己感觉刚开始培养细胞时，剥离脑膜非常仔细，而到后期，较为熟练时，剥离脑膜的工作就比较粗糙，经常脑膜剥离不干净。在剥离的细胞团块上带有表皮和结缔组织，在消化过程中很多神经细胞粘在结缔组织、粘膜上，表现为肉眼可见的絮状物。这种絮状物据我的经验与胰酶消化的时间没有太大关系。关键是你剥离神经外膜的时候一定要仔细，宁可多牺牲一些细胞也要把膜剥干净。不过，如果消化后还是出现絮状物，不要消化时间太长，对细胞的活力影响太大，以后的培养状况不会太好。即便出现絮状物，也可以种植细胞，只是细胞生长的密度可能不太均匀。
其他你说到的，关于在水浴还是培养箱，这个问题差别不大。
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发表于 2012-7-10 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的战友啊！！
回答cachet：雪旺细胞需要在预处理的培养瓶才能贴壁，建议你用进口的塑料培养瓶，不推荐用培养皿，因为很容易因操作不当导致污染。
我这周又做了一次，用胰酶和胶原酶消化1小时，然后胶原酶消化2小时，感觉还没有完全彻底消化，我用的0.3%胶原酶II（细胞：酶为1：3），感觉似乎主要是胶原酶在发挥主要作用，也许我应该加大用量，或试下胶原酶I可能会效果好点。
现在有一些雪旺细胞在生长，数量不是很多，还夹杂着成纤维细胞，我准备用g418干预去处掉，随时汇报进展，希望有战友给予指点，也希望同在培养雪旺细胞的战友多交流
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小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2012-7-10 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过甲状腺，回肠平滑肌 ，肾小球系膜细胞，甲状旁腺等细胞的元代培养，我建议你胰酶慎用因为消化时间掌握不佳会对你的细胞造成不良影响，可用胶原酶多次消化，最后再胶原酶与中性蛋白酶（如dispase,木瓜蛋白酶等）联合消化一次，可能对你的实验有点帮助。
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西子[使用道具]
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发表于 2012-7-10 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢啊，我下周做的时候试下单独用胶原酶消化，看效果怎么样
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-7-10 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不过用的也是一次性的塑料培养版，是不 是消化时间太久细胞死掉了？
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