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标题:[求助]培养的大鼠腹腔巨噬细胞为什么越来越少而且...

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发表于 2012-7-11 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]培养的大鼠腹腔巨噬细胞为什么越来越少而且...



我用1640培养液10％小牛血清，培养大鼠腹腔巨噬细胞，接种2小时洗去未贴壁细胞后数量还挺多，可是培养48小时后以pBS清洗两边准备做实验时发现细胞数量大量减少，而且细胞多呈圆形个大，长出伪足的细胞很少。同样条件下我的师兄作小鼠却做得很好。
我的培养过程：1、提前3天腹腔注射5-6ml无血清1640
2、断颈处死大鼠，75%酒精浸泡10分钟
3、打开腹部皮肤镊子提起腹壁，腹腔内一次性注射20ml1640培养液，轻柔腹部片刻。
4、止血钳提起腹壁，眼科剪腹壁剪一小口，吸出腹腔液体1000转离心10钟
5、弃去上清，再次6ml含血清1640悬浮细胞，计数超过107数量级，接种于6孔板中，每空1ml，再添加1640至2ml。孵育2小时后，PBS清洗2遍，继续孵育48小时。
请教高手指点一下我的实验过程有何不妥，究竟是哪里出了问题？不胜感激！
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发表于 2012-7-11 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你这个实验我也没做过。以前倒是作单抗的时候取过小鼠腹腔巨噬细胞。不过那时我也觉得巨噬细胞（铺开形状的）比起圆形（我觉得是红细胞等）来说是要少的多。随便提些参考意见：酒精泡10分钟是否长了点，我以前泡个几秒等小鼠湿透了就开始做了。是否有必要在老鼠肚子上剪口子？这个步骤会不会出血？我做小鼠是多用针筒多打空气进去，直到小鼠肚子鼓鼓的，然后把小鼠侧过来用同一个针头考下方往外吸。还有，你这也没正对照，不知那个大鼠是否本来就是腹腔巨噬细胞很少。不妨换个雌雄，胖瘦，年龄，品系不一样的试试。呵呵，随便说说的啊，试验成功了记得把经验告诉我哦：）
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发表于 2012-7-11 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是我与师兄的操作是一样的，他做的小鼠巨噬细胞长得很好，我做大鼠却不行，难道大鼠和小鼠有这么大的差别吗？
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-7-11 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你有没有作过鉴定啊？？
我以前也作过，里面看上去有两种细胞，我觉得圆的是单核细胞，另一种才是巨噬细胞，不过我还没有鉴定过

有没有图片啊？？这是我照的光镜图片，看一下啊


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发表于 2012-7-11 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

由于细胞没有达到实验要求所以我没照相，不过看楼主的照片好像长出伪足变形的也不多，并且细胞数量好像也不太多。难道大鼠的巨噬细胞就是伪足很少吗？看你的照片中细胞吞噬颗粒很多，你加了什么刺激剂了吗？
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发表于 2012-7-11 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有加刺激剂
我提取的细胞确实不多
这个倍数太低了（200x），所以看不到伪足,我们从扫描电镜下照片中可以很清楚的看到。
来源：小鼠腹腔
培养基：DMEM
培养时间：3天
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发表于 2012-7-11 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知哪位战友做过大鼠的腹腔巨噬细胞培养，给介绍一下经验吧，大鼠和小鼠真的不一样吗？
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发表于 2012-7-11 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有没有提大鼠KUPFFER CELL的?
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发表于 2012-7-11 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的1640里面加了谷氨酰胺和NAHCHO3了了没有，还有你的血清有没有灭活啊？
我做过肺的巨噬细胞的，一开始也是什么都没有加而且血清没有灭活，和你说的差不多，第二次用别人的配好的完全培养夜养了好几天左右都挺好的，你不妨试试
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-7-11 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你们培养那么长时间啊，我师姐也培养过巨噬细胞，但超过24小时后就开始死亡，怎么回事
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