[求助]请教MTT的加药方法问题

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标题:[求助]请教MTT的加药方法问题

H2O[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问各位战友,我用MTT法想在96孔板内加药,我是在孔内加了200ul的细胞悬液后，再将用生理盐水稀释好的不同浓度的药物（如1M，0.1M）加入孔中.但我的一位朋友说我这样加不对,因为生理盐水也成了一个处理因素,不同浓度的药物中生理盐水量不同,这样肯定不行,她说的药物浓度应该是200ul细胞悬液中的药物浓度(即孔中只有细胞悬液和药物,没有生理盐水).但我觉得这样不对.如果药物作用于动物,难道不是稀释好的药物浓度作用于动物,而是药物在每个动物中的浓度?这样讲不通的.

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道你加入的药物液体体积多少。如果体积大，生理盐水会有影响的。建议可以用生理盐水配制储存液，然后用培养基稀释成不同的浓度。这样可以减少生理盐水的影响。

whitesheep[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

直接用培养基配啊！我就是这样做的！

969[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意，应该用培养基稀释滴

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1。可以用生理盐水稀释药物，但一般都做成较高浓度的Stock,然后再用培养基稀释到需要的浓度。
2，很多药物是不溶于生理盐水或培养基的，所以有时还需要用别的试剂，但都要做成高浓度的Stock,最后都要用培养基稀释。
3。细胞培养时如果生理盐水或其他溶剂家多了会影响细胞的生长甚至存活！
4，我的经验是其他溶剂的两最好不要超过1%，这样对细胞的影响其本上可以忽略。
5。计算药物的浓度，要把培养基一块计算在内！

leifengta[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主和你的朋友说的都是有道理的，但这里想说几个经验：
1。药物应该先用说明书上推荐的溶剂来溶，直接用培养液溶是不合适的
2。加药时切不可一孔一孔地将药物母液加到培养液里。因为每孔培养液很少，加的药也很少，如此微量的加样将导致各副孔浓度相差很大。最佳的方法是，先算好所用培养液总量，加药，混匀，再将孔板中的培养液换成已加入药物的培养液，这样才能保证每孔浓度一致。
3。不同浓度组加入的溶剂量最好一致，这样更有可比性
4。药物的母液浓度应适当，过高，则加入时体积过小，难以加准确；过低则需要加入过多母液，母液溶剂对培养成分和体积会造成很大影响。比较合适的母液浓度是终浓度的1000倍左右。
5。加药时切记所有的体积都要在2ul以上，否则药物浓度肯定不准！

下面举一个例子来说明，希望有所帮助：
例：用药物A处理细胞B，根据文献推测A适合的终浓度在1－10uM，A说明书推荐溶剂为DMSO，推荐保存温度－20
1。配A母液，以DMSO溶解一定量A，终浓度为10×103 uM
2。以DMSO稀释A母液，配成2×103 uM、3×103 uM、4×103 uM、5×103 uM、6×103 uM、7×103 uM、8×103 uM、9×103 uM
3。种板，外围一圈加200ul PBS。连对照共设十组，分别为：对照、2uM、3uM、4uM、5uM、6uM、7uM、8uM、9uM、10uM，每组竖着6个副孔
4。种板后24h加药。取第二步配好的各浓度药物，每个浓度均取2ul,加入2ml培养液中，分别得到终浓度为2uM、3uM、4uM、5uM、6uM、7uM、8uM、9uM、10uM的培养液。对照组则取2ulDMSO加入2ml培养液中。
5。弃去原板中的培养液，加入上述含有药物的培养液

这样，对照组和处理组都是千分之一的DMSO，溶剂的影响可以忽略。而且每组各副孔的药物浓度也是一致的

H2O[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 leifengta 于 2012-7-12 13:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主和你的朋友说的都是有道理的，但这里想说几个经验：
1。药物应该先用说明书上推荐的溶剂来溶，直接用培养液溶是不合适的
2。加药时切不可一孔一孔地将药物母液加到培养液里。因为每孔培养液很少，加的药也很少，如此微量的 ...

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发表于 2012-7-12 13:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的药物A1用买时就带的碳酸氢钠1ml稀释,浓度是0.156mol/L,为便于计算,我用全培稀释成1.28ml,得到的浓度是0.2mol/L,我想以此作为母液浓度.
因为我的实验没有参考文献参考浓度,自己想摸索浓度.我设的浓度梯度是10倍,即0.2,0.02,0.002.......依次类推,最低浓度为0.00000002mol/L,按照您说的母液浓度是终浓度的1000倍左右,那我这样设计是不是不合理?请指点,谢谢!盼您的答复!

————————————————————————————————————————————————————————————————

我的不解之处是:为何在加入含有药物的培养液前要弃去原板中的培养液?
我设想的实验步骤如下:
1药物A1配成0.2M(方法如前述);取0.2M液体2ul入2ml培养液中,则浓度为0.2 mM,;取0.2 mM液体2ul入2ml培养液中,则浓度为0.2uM.
2种板:种板，外围一圈加200ul PBS。其余各孔加入含有细胞的全培100ul(悬液，已计算好细胞数)。
3取0.2M液体20ul入孔(已加100ul细胞悬液),再加80ul全培（不含细胞），这样孔中药物浓度为0.02M,
4取0.2M液体2ul入孔(已加100ul细胞悬液),再加98ul全培（不含细胞），这样孔中药物浓度为0.002M。
5取0.2mM和0.2uM配制0.02mM,0.002mM和0.02uM,0.002uM液体,方法同3,4。
6以上共9个药物处理组，每组设6个复孔。再设一个空白对照组（无药物，其余成分同处理组）。
您说：加药时切不可一孔一孔地将药物母液加到培养液里。因为每孔培养液很少，加的药也很少，如此微量的加样将导致各副孔浓度相差很大。那我这样做可行吗？

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

按照您说的母液浓度是终浓度的1000倍左右,那我这样设计是不是不合理?请指点,谢谢!盼您的答复!
所谓1000倍左右是为了减少溶剂的影响,因为这样的最终溶剂浓度在千分之一左右,对整体的影响是很小的,
当然,倘若溶剂成分和培养液成分接近,就不必太过在意这一问题
1ml稀释,浓度是0.156mol/L,稀释成1.28ml,得到的浓度是0.2mol/L,稀释后浓度怎么变大了呢?呵呵,不明白哦
有一个简单的方法可以检验溶剂的影响,那就是设正常培养组和溶剂对照组,看看加溶剂后对培养究竟有多大影响

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楼主的方法并非不可以,只是这样各组间药物溶剂量好像是不一样的,难说对结果是否有影响
4取0.2M液体2ul入孔
这一步,取2ul,量比较少哦,所以误差会相对较大
其实MTT是比较粗糙的实验,各副孔间一定要尽量保证一致的处理条件,这样的结果才比较可信

个人愚见,仅供参考,呵呵

newway[使用道具]
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发表于 2012-7-12 13:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

mtt只能看看一个趋势具体的数值是很不稳定的还存在着仪器误差

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