[求助]我做的MTT实验总是一塌糊涂，万分沮丧

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标题:[求助]我做的MTT实验总是一塌糊涂，万分沮丧

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做了小鼠脾细胞增殖实验好几个月了，但一直没有很确切的结论，绝望中。
实验基本是按照实验书的操作进行的。细胞数做过1×105、2×105和4×105/孔，加完细胞后加药，培养72小时，结束前4小时加MTT，4小时后加三联液，孵箱内放置过夜，570nm测定。实验过程有个问题总是困扰着我：加完MTT培养4小时后，通常发现光加培养液的孔颜色很深，有时发红，这样加三联液后颜色就很深，测定值通常为0.4－0.5；加细胞的孔加完MTT培养4小时后，有时呈草绿色，有时是深绿色。上次做的细胞数是4×105/孔，加完是草绿的，加三联液后测定值在0.6－0.7；这次做2×105/孔，加完MTT后是深绿色，结果测定值所有的孔都是0.5－0.6，一点区别都没有。
加完MTT培养镜下观察，细胞孔均见针状结晶，加药孔比不加药孔感觉还多，不加细胞孔没见到结晶，加完三联液过夜镜下已不见细胞和结晶，应该全溶了，但为什么各孔颜色会一样？
不知各位做过的大虾能否不吝赐教，不胜感谢。

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加的什么药啊？

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ladyhuahua 于 2012-7-12 15:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

加的什么药啊？

你好，我的最大疑惑是：加ConA(1-20ug/孔）与对照孔（只加细胞）和空白孔（只加培养基）经常吸收值一样高，现象就如上面所说，已重复了多次，但不知是何原因？听说空白孔的吸收值应该很低的，我做的总是在0.5左右，但从不见有结晶。今天刚做了一次，又是整板一种颜色，真急死了。

TAT[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主你好我做兔子外周血液的淋转也遇到了你同样的问题：加ＰＨＡ(５-60ug/孔）与对照孔（只加细胞）常吸收值差不多，但我用同样的试剂做牛外周血液的淋转，刺激的很好．但我的空白孔（只加培养基）与加ＰＨＡ(５-60ug/孔）与对照孔（只加细胞）常吸收值相差0.2－0.3左右．

wood533[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是我做MTT的实验步骤：将细胞以1×105/ml浓度接种于96孔培养板，100μl/孔，设8孔重复，孵育过夜；细胞贴壁后，用无血清培养液孵育24h，使细胞同步；弃上清液，以培养液配制不同浓度的药物100μl/孔，孵育24h，加入MTT液50μl/孔，继续孵育4h，倒置相差显微镜下观察，可见蓝紫色针状结晶；吸去上清，加入DMSO100μl/孔，室温振荡15min，待结晶完全溶解，酶标仪550nm波长检测吸光度值。

注 MTT可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上几位!是否能给我说一下加完MTT培养4小时后各孔的颜色变化？加培养基孔颜色变成深绿色甚至发红是不是有问题？加细胞的孔是绿色吗？

dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

结晶为兰紫色，溶解后更偏向于紫色，从没碰到你说的什么不同的绿色，是否MTT母液和/或溶解液都有问题，另外加入溶解液后几分钟即可检测，我看的文献中从没提到要过夜的，我检测的波长也是570nm,不果溶解液是DMSO，因为我个人实验三联液溶解性很差，或许真要温育较长时间才可溶解结晶，不果你也可用DMSO试试，反正无妨

小螺号[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

培养基PH值偏低，7.0以下时，四唑盐还原产物formazan偏红色，PH值7-10之间可产生红色和紫色两种产物，PH11.0以上则只产生紫色产物。

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发表于 2012-7-12 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得是过夜的问题，经典的MTT实验都是在加MTT4小时后，加DMSO溶解结晶，直接上机检测OD值的，不知道你过夜的方法是参考哪里的做法？过夜孵育时有没有注意避光？我记得加入溶剂溶解结晶后时间太长，各个孔的颜色都会变成一样的。供参考，继续关注中！

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-7-12 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是从一本参考书看到三联液的方法的（书名忘了），书上说的也不是三联液，是SDS加HCl，而且说显色稳定；我后来在这里看一些帖子提到三联液，还有就是海洋饼干提供的一个精华贴里有一个试剂盒的说明书，虽然没有提到用什么溶解结晶，但是也需要放置几小时或过夜，我想可能也是类似的东西。因为不用去培养液，比较适合悬浮细胞，而我没有离心机，所以一直没有考虑用DMSO或酸化异丙醇，虽然我也从来没有在国外的文献上见过三联液法。
我用三联液法一直没有做到过空白孔的吸收值在0.1以下，而且高达0.4－0.5。有时给药组吸收值高些，0.6－0.7，有时就和空白孔一样。我也找不出原因来。
我昨天请教别人，他说可以用轻翻板法去液，然后加DMSO溶解，我也打算换个方法试试。唉时间紧迫，经不起折腾了。
感谢楼上三位的意见，对我帮助极大。谢谢！

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