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标题:[求助]原代肝细胞培养

kuaizige[使用道具]
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发表于 2012-7-17 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]原代肝细胞培养


大家好！我是细胞培养方面的新手，最近开始分离培养原代大鼠肝细胞，采用胶原酶消化法，在很多文献上都提到用500转离心5-10分钟，我试了，发现肝细胞沉淀的好像不是很好。分离所得的肝细胞数量与文献上报道的有相当差距，细胞贴壁的也不好。另外，分离后接种的培养瓶中发现有点浑浊，换液后就好多了，是不是污染，还是其他的原因？还有就是什么时候行细胞换液比较合适呢？是全部换液还是半量？请大家多多指教！小弟不甚感激！
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发表于 2012-7-17 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在分离培养原代肝细胞，采用胶原酶消化法，但用的是小鼠，因为灌流液和胶原酶用的都很少，直接用注射器推入就可以了，整个操作过程时间短避免了污染，所得肝细胞的确是悬浮的，贴壁不好。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-7-17 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在做原代人肝,直接小块用针头打碎,不用酶.头一天加血清,然后不加血请培养,长得还不错
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发表于 2012-7-17 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

什么时候行细胞换液比较合适呢？是全部换液还是半量？还有就是肝细胞如何纯化？感觉有很多杂细胞？
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发表于 2012-7-17 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

据文献报道在培养瓶底部铺上一层胶原，可增加肝细胞的贴壁，有没有效果？具体要怎么操作呢？100 ml 的培养頩大概需要加多少？
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发表于 2012-7-17 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶原酶消化后取出肝脏，以1640培养基终止消化，然后三层纱布过滤一次，200目筛网两次，500转/分离心两次，30%PERCOLL溶液2000转/分离心后，最下层的就是纯化的肝细胞。
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发表于 2012-7-17 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能不能具体点？500rpm离心几分钟合适？PERCOLL溶液是什么成分？2000rpm需要多少时间？
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 小中大

500转/分2分钟离心两次，30%PERCOLL溶液2000转/分离心5分钟后，最下层的就是纯化的肝细胞。
30%PERCOLL溶液100毫升的配制方法就是27毫升PERCOLL原液+3毫升10倍的PBS+70毫升PBS,只需取50毫升将沉淀进行密度梯度离心就可以了.
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发表于 2012-7-17 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问 13HUI 30%PERCOLL加的是70ML还是60ML PBS啊，27MLPERCOLL应该是90ML体积啊
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kuaizige[使用道具]
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 小中大

我用500rpm离心后发现肝细胞沉降的不是很好，丢弃上清液时损失很多肝细胞，不知道是什么原因？
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