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标题:[求助]请教RAW264.7为什么易老化？

知了知了[使用道具]
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发表于 2012-7-19 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教RAW264.7为什么易老化？



请教高手，RAW264.7为什么传几代后就老化了？？？形态变化极为明显，是不是自己分化，有何办法能解决这个问题？否者这样做试验很辛苦啊！
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发表于 2012-7-19 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RAW264.7传几代后就老化了,形态变化极为明显，有何办法能解决这个问题啊?高手帮帮忙啊!!!
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发表于 2012-7-19 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人曾经养过RAW264.7，该细胞属于小鼠巨噬细胞，很好养，增殖能力很强。由于不知道你的具体情况，不好回答。
例如：
（1）过去养得很好，现在不行了。可能的原因有细胞的生长环境发生了改变，例如配培养基的水发生了改变，CO2的浓度发生了改变，血清的批次不同。但是简单的排除方法就是用相同的东西培养另外一种细胞，看另外一种细胞的生长情况，如果出现类似情况说明是环境的问题。如果不是就是细胞本身的问题，例如传代不及时导致细胞老了，处理办法是重新复苏细胞。此外为了进一步排除是否为自身原因（例如新手上路），请有经验的同学或老师代为培养一段时间观察。
（2）如果是刚养这种细胞，例如刚买来的，刚要来的，刚复苏等。那可能是细胞对新环境的不适应，通常调整一段时间后能够漫漫恢复。
（3）此外你说的老话指的是什么情况/是细胞出现了颗粒，还是细胞变成了长条形。
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发表于 2012-7-19 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人培养RAW264.7已经大半年了,细胞复苏成功几率低,常常是5-8株中才有一株能成功复苏.其他株经常是第2天换液或传1代后就出现细胞老化的现象,比如细胞长出伪足,颗粒增多,无光泽,胞浆中出现空泡,细胞贴壁能力强,胰酶难以消化下来.最后老化的细胞越来越多,停止增殖. 细胞冻存严格按照细胞冻存的流程进行.不知是那一步出现问题.
RAW264.7培养从今年春天开始到现在,他的贴壁能力变化大.刚买来的时候,即使0.25%胰酶作用10分钟都难下来,一般都要作用2-3次才行.现在细胞好的时候,2-4分钟就消化下来了,而且胰酶作用时还没有放至37度中.奇怪!!!
我一般消化的时候,先用D-Hank‘s液洗2次,加0.08%胰酶作用2-4分钟,将吸管吸走已脱落的细胞,再将培养液加入瓶中,吸管吹至细胞脱落,瓶壁干净为止.然后离心1000转,5分钟.
如果细胞老化增多,我将D-Hank‘s液洗2次,加0.08%胰酶作用2-4分钟后,将吸管吸走已脱落的细胞,然后离心1000转,5分钟.扔掉瓶底剩余细胞,用0.25%胰酶消化10分钟,用培养液洗干净.再重新接回瓶中.
请高手指点.谢谢!!!!
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-7-19 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正在养。如果有伪足出现或细胞生长状态不好，多半是没有去热原或去热原措施不足，与PH关系不大（7.2-7.4）。建议：容器用去热原处理，同时用MILIPORE的去热原超纯水配制培养基和试剂。如果想确定热原含量，建议测定试剂中的LPS含量（例如用鲎试剂测定）。我培养264.7从来不消化的，因为消化后反而更难吹打下来，具体原因不明。可能与细胞特性有关。

建议上传照片！
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发表于 2012-7-19 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

因为老化的细胞都被我处理掉了,所以没有照片.
因为之前我都用原装的培养液，除D-Hanks,胰酶外,而去热原的方法很多,所以请教怎么高效可行的除去热原？那些步骤需要去热原?国外是有文章说LPS可诱导RAW264.7分化,但试验中那一环节出现问题,小妹实在不知道.
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-7-19 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

塑料材料辐照处理；玻璃吸管、容器高温240度2 h；自己配制DMEM，水如上方法处理（MILIPORE水）。细胞生长很快，一般传代后2天即长满，有时候成团生长，不是单层铺于瓶底。


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知了知了[使用道具]
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发表于 2012-7-19 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我细胞生长好的时候也增殖极快，一般传代后2天即长满，成团生长，不单层铺于瓶底,而且很难打成单细胞.
请问高手们还有其他环节出错吗？
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sunnyB[使用道具]
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 小中大
我没有培养过这个细胞，但是据我所知RAW264.7并不能说是巨噬细胞，只能说是永生化的单核细胞，要作为巨噬细胞用的话，还得用PHA诱导的，希望大家实验时不要搞错了，呵呵.......

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个人曾经养过RAW264.7，该细胞属于小鼠巨噬细胞
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 小中大

RAW264.7是鼠单核巨噬细胞,是目前破骨细胞的诱导模型.所以不能用PHA诱导,不然就会分化为成熟的破骨细胞.
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