[分享帖]总结的MTT方法原理

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标题:[分享帖]总结的MTT方法原理

wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一、  原理
黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

二、实验步骤（实用于贴壁细胞）
1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。
3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。
4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）然后吸掉上清，每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7）  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
8）  计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 wmp1234 于 2012-7-20 12:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一、原理
黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波 ...

有依据吗？或者来源？

了了[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用MTT作药物的增值情况，看过楼主的也想写一些。
1.文献很多用470nm作为测定波长，也有用双波长来测定。我用双波长测吸光值。
2.加入待筛选样品后的培养时间最好也自己考察，每种样品的作用情况都不一样，我的样品就是在加药48小时时最佳。
3.关于调零孔：二甲基亚砜遇光不稳定，变黄。楼上说低速振荡10 min是否在蔽光状态下操作？本人试过加完培养基、MTT，吸尽溶液后，再加二甲基亚砜，分别于2-3min,和15min时于双波长下测吸光值，发现值分别大约为0.05，0.3，差别大，而样品孔变化有细微差别不大。不过我用的是国产的，国外产品没测过。我想应尽快测。能自己考察一下测定时间最好。
另外，二甲基亚砜会腐蚀微量取样器，用时小心别再沾枪身上，我已经被二甲基亚砜弄坏一把微量取样器了。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）”中“相同浓度的药物溶解介质”是什么东东啊？能帮忙解释一下吗？

了了[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

指溶解药物的溶剂，比如样品使用乙醇溶解，即指乙醇。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果用二甲基亚砜溶解药物的话，还能加20ul么？二甲基亚砜不是对细胞也有毒性么，看文献说不能超过0.5％的，那要加多少合适呢？

49888[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近也在做MTT,每次做3个复孔,因为做时间依赖,每次用一块96孔板,是不是太浪费了,有没有好的办法?

tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MTT感觉不如cck－8方便

guagua[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MMT的效果确实不错，重庆医科大学已经做了很多。
如果对MTT有疑问，可以参考最近出版的《现代肿瘤学基础》。这本书对MTT用于检测细胞生长和肿瘤药物筛选有着详尽的表述。

skytree[使用道具]
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发表于 2012-7-20 12:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果用二甲基亚砜溶解药物的话，还能加20ul么？二甲基亚砜不是对细胞也有毒性么，看文献说不能超过0.5％的，那要加多少合适呢？

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测的时候就=你不要这个细胞了，如果你板上还有其他细胞要继续培养，建议你吸出来测OD值

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