细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]冻存、复苏失败，原因何在？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]冻存、复苏失败，原因何在？

orangecake[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77305
精华 0
积分 512
帖子 724
信誉分 100
可用分 4431
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
1

发表于 2012-7-21 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]冻存、复苏失败，原因何在？


我刚培养B95-8细胞一个月左右，提取并保存了EBV，但解冻（1分钟内溶解）后用来感染淋巴细胞，一周多了，还没有观察到淋巴细胞形态发生改变，真是郁闷啊。我怀疑是不是提取的EBV浓度不够（拷贝数不高）。另外，由于培养箱进行维修，我将B95-8全冻存起来，可是复苏时却没有一个能复苏成功。
我冻存的方法是：RPMI 1640培养基 70%，新生牛血清（Hyclone，为了省钱啊）20%，甘油10%；4℃ 2小时，-40℃ 5小时左右，然后置-80℃（我们这边没有液氮罐啊，上届同学培养时老板不让买呀）。冻存时间大约10天左右。结果复苏发现有很多细胞碎片，我想细胞在冻存时已经破坏了（我冻存前用胰酶消化了的，传代时也用胰酶消化，但传代却没有问题，细胞生长也很好）。我就不明白，我倒底错在哪里了。
另外，请问哪位战友能赠送一点B95-8细胞给我？或者给钱，你开个价吧。
顶部
u234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77031
精华 0
积分 691
帖子 1081
信誉分 100
可用分 6196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
2

发表于 2012-7-21 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Do not put your cells at -40℃ so long.
my protocol: 4℃ 1小时，-20℃ 2小时左右，然后置-80℃
90% FBS + 10% DMSO
顶部
idea2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77656
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态 离线
3

发表于 2012-7-21 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4℃ 2小时，-40℃ 5小时左右，问题在这里了。-60度以上是细胞的危险温度了，要控制好时间
我的细胞是：4度 30分钟，-20度 一小时，-80度（过夜－－数月都没问题），-196度。
跳过-20 OR -80度，直接从4度过渡到-196度都做过。冻存一样成功
20％的FBS不是大问题
顶部
u234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77031
精华 0
积分 691
帖子 1081
信誉分 100
可用分 6196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
4

发表于 2012-7-21 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1。细胞冻存和复苏要遵循“慢冻筷融“的原则。就是说冻存的时候要有梯度的降温，但是复苏细胞的时候一定要动作快点提前水浴锅加热到37度，拿出细胞后快速投入，使其溶解，缩短其在0—4度的停留。
2。注意冻存前细胞的活性，这一点很重要。尽量选增殖活跃的细胞，长到70-80%后胰酶消化，加培养基中止，离心弃去胰酶后加冻存液。我们用的冻存液中DMSO浓度为6%。
3。冻存和复苏时都要确保无菌，呵呵。
顶部
00无名指00[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76070
精华 0
积分 493
帖子 666
信誉分 100
可用分 4151
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2012-7-21 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

>20％的FBS =10%DMSO没有问题
应该是温度控制的原因.
建议买冻存盒.
如果实在不能买,可将细胞管包好浸泡在室温的异丙醇中,一同放入-80度冰箱1-2天.
不必4度,-20度转来转去
顶部
glass[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76223
精华 0
积分 715
帖子 1109
信誉分 100
可用分 6373
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2012-7-21 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

支持楼上观点，甘油可以换成10%DMSO，4度半小时，-20度一个半小时，然后放在-80度低温冰箱可以保存两个月，用液氮可以保存更久，不过我们没有。感觉-80度保存也挺好的。
顶部
bongte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 80083
精华 1
积分 419
帖子 433
信誉分 102
可用分 3071
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-20
状态 离线
7

发表于 2012-7-21 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的方法： 4℃ 1小时，-20℃１小时左右，不能太长时间容易形成冰晶，然后置-80℃ 过夜，再转入液氮保存．
90% FBS + 10% DMSO
复苏的时候放入３７度的水迅速解冻，５００rpm离心３min，弃上清加入新鲜的培养液培养，２４h后换液即可
顶部
jrwyyplt[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79380
精华 1
积分 406
帖子 488
信誉分 102
可用分 3193
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
8

发表于 2012-7-21 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有B958细胞,在北京,你在哪?可以购买
顶部
911[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73229
精华 1
积分 523
帖子 682
信誉分 102
可用分 4276
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
9

发表于 2012-7-21 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

-20℃到-60℃是危险区,这一步时间一定不能太长,否则容易形成冰晶.一般-20℃两个小时后就要转移到-80℃冰箱.-80℃通宵后放入液氮罐里.甘油换DMSO我觉得影响不大，最好是能买个程序冻存盒，方便，而且细胞成活率高．
对了，还有冻存前细胞的状态也很重要，最好是用对数生长期的，效果会好很多．
顶部
october7[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77254
精华 0
积分 448
帖子 616
信誉分 100
可用分 3856
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
10

发表于 2012-7-21 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚培养B95-8细胞一个月左右，提取并保存了EBV，但解冻（1分钟内溶解）后用来感染淋巴细胞，一周多了，还没有观察到淋巴细胞形态发生改变，真是郁闷啊。我怀疑是不是提取的EBV浓度不够（拷贝数不高）。另外，由于培养箱进行维修，我将B95-8全冻存起来，可是复苏时却没有一个能复苏成功。
我冻存的方法是：RPMI 1640培养基 70%，新生牛血清（Hyclone，为了省钱啊）20%，甘油10%；4℃ 2小时，-40℃ 5小时左右，然后置-80℃（我们这边没有液氮罐啊，上届同学培养时老板不让买呀）。冻存时间大约10天左右。结果复苏发现有很多细胞碎片，我想细胞在冻存时已经破坏了（我冻存前用胰酶消化了的，传代时也用胰酶消化，但传代却没有问题，细胞生长也很好）。我就不明白，我倒底错在哪里了。
顶部
 13  1/2 12››