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标题:[求助]大家帮忙看看我的MTT步骤！

吴才子[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]大家帮忙看看我的MTT步骤！


请大家给与指点，为什么我做出的MTT结果总不理想呢？我做食品中某种成分的抗癌效果，用临床上的化疗药做阳性对照，可现在连阳性药的结果都做不出效果来，十分困惑，毕业在即，肯请大家赐教！！！
常规方法消化收集细胞（ＳＧＣ７９０１），制成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105/ml接种至96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μl（相当于1×104个），以不含细胞的培养液作为空白。将培养板置于37℃、5% CO2培养箱中贴壁培养24h后，各孔分别加入100μl的药物溶液（以生理盐水配置），每个浓度设6复孔，以5-氟脲嘧啶作为阳性对照，以生理盐水作为阴性对照。分别培养24、48和72h后，每孔加入MTT 20μl，继续孵育4h后，快速翻板倒掉培养液，每孔加入100μl DMSO，水平振荡5min后用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度值。
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铜雀[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各孔分别加入100μl的药物溶液（以生理盐水配置）

————————————————————————————————

一般用缓冲液或直接用培养液配置吧，没听说过用生理盐水配的
MTT这种方法本身就不敏感
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我曾经做过的MTT的步骤，供参考，祝好运

1. 倾去培养液，加入无菌的PBS(pH=7.4)荡洗3次。再按照无血清的培养液与MTT染液9：1的比例共加入500μL，置于培养箱中培养4小时。
2. 弃上清，加入500μL DMSO，室温下裂解30min，使颜色颗粒充分溶解。
3. 取0.2mL待测液加入到96孔细胞培养板中，酶标仪测定吸光度值。

这个是在48孔板中测的，用96孔板测最后就不用转了
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我感觉您的细胞悬液体积与药物体积不大合适。我一般为9:1,前提是得保证药物的终浓度，药物体积太大，培养液被稀释（药物最好用培养液配制，生理盐水也可以，但体积不能太大），影响细胞生长的。您的药物是否溶于培养液需做预实验的。
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吴才子[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做MTT的具体方法是在细胞经过各种所需处理后（比方说损伤或加药后），直接在96孔板中加入MTT（储存液浓度为5mg/ml，使用时用PBS稀释，终浓度为0.5mg/ml）, 37℃，5%CO2培养箱内孵育 4-6小时，用扣板法将上清液弃掉（扣板法可能会将紫蓝色甲瓒颗粒倒出，所以也可以用枪吸出），然后加入二甲亚砜（DMSO）200ul/孔，轻摇培养板，使甲瓒颗粒完全溶解后，用全自动酶标仪波长为550nm测定OD值。
药物可以用生理盐水，但有些生理盐水偏酸，我一直用pbs配置。
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得你的细胞接种密度有点高，应该下调再试一下，基本上万/ml差不多，而且随着药物作用时间的延长，相应的细胞接种密度应该随着降低。加药的体积太大了，应该为细胞悬液的十分之一或二十分之一。生理盐水的比例太大会影响细胞的生长。如果细胞不能正常生长怎么能体现出药物的抑制作用呢？还有，我认为最后将培养基从孔内吸出比扣板的方法更能减小误差，当然吸的时候要注意别碰触到底部结晶。别的步骤倒是没有什么问题。
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leifengta[使用道具]
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 小中大

个人觉得细胞贴壁后，可以吸掉原培养液，每孔再加入用培养基配置的药物100ul。24H后 原来的100ul培养液可能已经变酸，再加入100ul 生理盐水配置药物，培养液浓度进一步稀释，可能细胞状态不好。如果你的药物必须溶在生理盐水中，建议你配成高浓度，然后用培养液系列稀释，再加入96孔板。再有，也可能你的药物浓度低，所以效果不明显。细胞密度每孔1万，个人觉得是可以的。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以吸掉MTT液体的，加入MTT4hrs之后，直接加入酸化的百分之10SDS来溶解。可以防止吸掉结晶。
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、我觉得加入DMSO溶解的时间太长了，空气中氧化还原的物质不要太多阿。MTT的原理就是一个脱氢酶还原反应。所以，时间长了，差异就小了。你觉得呢？震荡5分钟就可以了。
2、药物加样量太大，培养体系变化太大了。
3、培养时间长的时候，中间一定要加一次培养基的。
4、加MTT的时候要弃掉培养基和样品，防止还原性样品影响结果。
5、接种量还可以的。显微观察空白组细胞是否已经出现分裂，可以确定细胞生长状态，再进行下一步显色。
6、扣板，不如用1毫升注射器吸取。
仅供参考！
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BUK[使用道具]
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发表于 2012-7-22 14:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上这位朋友用1ml注射器吸掉培养液倒是没试过，下次板少的时候试试看。可是板多的话，吸起来可是够辛苦的！
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