细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]作LDH，细胞膜不破怎么办

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]作LDH，细胞膜不破怎么办

BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
1

发表于 2012-7-22 19:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]作LDH，细胞膜不破怎么办



最近作LDH测细胞乳酸脱氢酶漏出率，可是加过氧化氢损伤1~4h后，细胞只是变圆，却不破膜，所以测出的胞外值非常小，根本没有意义。如果用MTT法，在两小时时损伤率已经达到一半了。
怎么回事，有什么好办法使细胞破膜，得到相符的值吗？
有谁用细胞做过LDH，能说说你是怎么做的吗？不甚感激~
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
2

发表于 2012-7-22 19:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
乳酸脱氢酶释放率(%)=培养基中酶活/(培养基中酶活+细胞层酶活),试验中需要同时检测培养基和细胞裂解后细胞悬液中的乳酸脱氢酶的活力即可.
简单步骤:收集移出培养基后,用PBS洗涤细胞2~3次,加入与培养基等量的1~2%曲拉通37℃裂解细胞30分钟(也可以用超声破碎仪破碎细胞),然后即可检测计算了.
另外MTT法是通过线粒体中的琥珀酸脱氢酶代谢实现间接反应细胞活力,原理基本同CCK-8(通过溶酶体代谢),这种方法检测结果和乳酸脱氢酶释放率是有差别的,后者更准确些,比如细胞膜损伤,通透性增加,乳酸脱氢酶释放率增加,但只要线粒体功能未被破坏,那么MTT可能检测的抑制率就不能反应实际毒性情况.
最后提一下,注意在用PBS洗细胞时,加入PBS沿孔周轻轻加入,吸出也要细心,以免丢失细胞,还有裂解细胞要完全,这些因素都会造成较大试验误差.
顶部
BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
3

发表于 2012-7-22 19:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可是加损伤后细胞只是变圆，却不破膜，怎么办呢？是不是和细胞种类有关呢？有的细胞膜容易破，有的就不容易破啊？请问你做LDH时，作用多久使细胞膜破损呢？多谢了
顶部
summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
4

发表于 2012-7-22 19:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做这个实验也好几次了，但总出不了结果，我用的是南京建成的试剂盒，我想问一下到底要多少细胞量，有的战友说要达到107次，天哪，我难道要用dish养才能测。我想问一下你具体是怎么做的，是96孔板吗，细胞密度多少，多少体积的培养基，吸取多上测上清，裂解液加多少，最后测的时候那个酶又是加多少，因为建成的试剂盒要的体积很大，我是按比例缩小做的。如能回答，我真是太感谢了。还有我发现培养基本身在440的吸收就很大，因此想换无酚红的做，不知道你是怎么做的。
顶部
BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
5

发表于 2012-7-22 19:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也作好几回了，可苦于出不了结果，加200uM过氧化氢作用2~4h，细胞不破膜。是不是需要加大浓度，加长作用时间？你是用多大浓度过氧化氢，作用多久啊？
我是用96孔板，密度是2×104 次，做的时候是细胞尽量长满吧。我一直用无酚红培养基，这样才能消除培养基颜色的干扰，有什么好方法，请多交流吧！
为什么要用PBS洗啊？
顶部
summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
6

发表于 2012-7-22 19:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞变圆也是一个毒性指标（具体文献查到再贴），至于药物作用多久，一般选取24、48和72小时。对与皂苷类有较强的溶血活性，毒性剂量下作用10～20分钟就可以观察到细胞的裂解。
TO honvey：我们也是用的建成试剂盒，在96孔板中培养细胞，每孔细胞大约70～80％孔底给药，共200微升。试验中节约试剂，可以将试剂同时缩小1／5量，培养液和细胞裂解液各20微升。
另外关于酚红干扰问题，我采用了双坡长法除去非特异吸收干扰和不加辅酶对照。
TO wenwen1314：“为什么要用PBS洗啊？”的问题 ，这个试验是求得每孔细胞中有多少LDH％释放了，细胞层LDH活力代表没有释放的部分，如不用PBS洗，求的细胞层LDH活力比实际大，LDH释放率结果比实际小。
顶部
summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
7

发表于 2012-7-22 19:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
（o.4倍量）基质缓冲液 100微升
辅酶 I20微升
2,4二硝基苯肼 100微升
NaOH 1ml
顶部
BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
8

发表于 2012-7-22 19:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞变圆也是一个毒性指标（具体文献查到再贴），至于药物作用多久，一般选取24、48和72小时。对与皂苷类有较强的溶血活性，毒性剂量下作用10～20分钟就可以观察到细胞的裂解。
TO honvey：我们也是用的建成试剂盒，在96孔板中培养细胞，每孔细胞大约70～80％孔底给药，共200微升。试验中节约试剂，可以将试剂同时缩小1／5量，培养液和细胞裂解液各20微升。
另外关于酚红干扰问题，我采用了双坡长法除去非特异吸收干扰和不加辅酶对照。
TO wenwen1314：“为什么要用PBS洗啊？”的问题 ，这个试验是求得每孔细胞中有多少LDH％释放了，细胞层LDH活力代表没有释放的部分，如不用PBS洗，求的细胞层LDH活力比实际大，LDH释放率结果比实际小。

————————————————————————————————————————————————————————————————

多谢~~
可是细胞只是变圆，却不破膜，所以测出的胞外值非常小，根本没有意义。怎样才能让细胞破膜，提高胞外值，得出合理的胞外值呢？不然实验就得不到结果了。是否需要提高过氧化氢损伤的浓度和时间？请帮忙~~
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
9

发表于 2012-7-22 19:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们用LDH测的细胞的死亡率，用的是Triton破坏细胞膜的
还可以
顶部
BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
10

发表于 2012-7-22 19:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们用LDH测的细胞的死亡率，用的是Triton破坏细胞膜的
还可以

——————————————————————————————————————————————————————————————

我是测定乳酸脱氢酶的漏出率，需要测细胞外和细胞内两个值，然后用细胞外值/（细胞外值+细胞内值），即为所测定的漏出率。
测细胞内值是使用Triton破坏细胞膜，释放出乳酸脱氢酶。
我想知道的是如何破膜，提高细胞外值？
顶部