细胞世界

以前在学校里做过药物处理前后蛋白从核外向核内转移的，用以下方法，效果理想，不妨一试。
1）处理盖玻片
2）接种细胞，待爬片后处理细胞
3）-20℃预冷的甲醇固定30″～1min；
4）PBS洗，2×3min；
5）用1％BSA封闭液（含0.1％TritonX-100（V/V）的PBS配制）封闭细胞，室温，1 hr；
6）一抗孵育（一抗稀释液为0.5％BSA，PBS配制），4℃过夜；
7）PBS洗，3×3min；
8）二抗避光孵育，室温，1h；
9）PBS洗，3×5min；
10）取小玻片，暗处晾干；
11）激光共聚焦显微镜下观察，摄片。

注意：
1）盖玻片的处理很重要，是得到良好结果的前提
2）甲醇一定要足够冷，固定时间最好不要超过1min，否则影响细胞形态，且在后来的处理中容易脱落
3）TritonX-100用0.1％（V/V）即可
4）一抗孵育时间一般为24h，但若信号太弱，也可增加至48～72h，但时间长了也可能增加非特异性；
5）二抗孵育45～60min足矣
6） 因为是染核，所以有光镜的细胞照片对照看，比较好判断些
从上图看，可先不调一抗浓度，改变一下实验方法，或许可以得到好的结果。

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谢谢您 的指教，我想你甲醇是不是跟我一样是打错的，我打甲醛老是打成甲醇？我用的是甲醛固定的。另外“-20℃预冷的甲醇固定30″～1min
”，固定那么少时间行吗？
我明天就试试你这种方法。
你可以把你以前做过的图片贴一张给我看下吗？如果不方便的话也可以发我邮箱。