小中大【分享】PCR基因扩增
一、实验原理
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。 PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链;②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间;③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。 现用图示说明PCR原理:
二、仪器及试剂
1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等
2.试剂： 10X PCR 缓冲液配制(部分随Taq酶提供)： 250～500 mmol/L KCl 100～500 mmol/L Tris-Cl(pH8.4) 15～20 mmol/L MgCl2 0.5% Tween-20 1mg/L BSA 其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶、等三、操作步骤 1. PCR 体系(40ul)： 4ul 10XPCR 缓冲液 4ul 25mM MgCl2(根据不同公司PCR 缓冲液的不同而定) Xul 模板DNA ≥50ng 1ul 上游引物(50-100ng) 1ul 下游引物(50-100ng) 1ul dNTP Mixture(终浓度20-200uM) 0.4 ul Taq聚合酶加ddH2O至40ul 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
