[求助]细胞转染48h后几乎全部死亡！

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标题:[求助]细胞转染48h后几乎全部死亡！

8s5g[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是promega Max试剂盒提的质粒，用乙醇沉淀过了，溶在TE中，
转的时候没用抗生素，对照细胞生长正常，用的是lipofectamine 2000的。
怀疑是质粒的质量不好，可是不知道是不是这个原因，求救！！~怎么办啦~~

感激你们给我任何建议~~~和意见~~~~

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发表于 2012-7-24 12:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外，我用EGFP质粒转也是大量死亡~
怎么办~~~啦~~

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发表于 2012-7-24 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 8s5g 于 2012-7-24 12:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的是promega Max试剂盒提的质粒，用乙醇沉淀过了，溶在TE中，
转的时候没用抗生素，对照细胞生长正常，用的是lipofectamine 2000的。
怀疑是质粒的质量不好，可是不知道是不是这个原因，求救！！~怎么办啦~~

感激你们给我任何建 ...

你的对照细胞是什么呀，是空质粒转的吗？

我觉得你这很有可能是细胞密度不够，最好是长到90％之后再转比较好

另外，细胞转染之后大量死亡是正常的，只是如果都死了的话才不正常，你可以把细胞接着养，说不定就能长起来

我曾经做过一种质粒的转染，转染之后几乎看不见活细胞，但是接着养几天后会发现一个一个的细胞克隆，而且都是转进去的细胞

所以，你可以如下解决：

1。将转过的细胞不要扔，接着养3～7天看看

2。你再转一次，这次要等细胞长到足够的密度再转

试试看，希望成功

8s5g[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢你的建议。不过我的细胞密度从50%-98%，这个范围我都试过。
对照用的是不加质粒的LP2000

8s5g[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用显微镜观察EGFP发现转化率还可以，大约在60%以上，可是就是到了48小时左右就几乎全部死亡

我会继续培养看看

abc816[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转染后三小时换液，LIPO的细胞毒性还是比较明显的。

rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的小建议：
1 细胞密度要够(80-90%)，不过最好还是随细胞而定的.
2 质粒纯化的问题。是不是内毒素free的，是不是乙醇没有洗干净，（乙醇你用的没问题吧，是不是很好的乙醇，有没有混有甲醇也不一定）再有是不是质粒的定量有问题，造成加入的质粒太多。
3 脂质体的量可以按比例（与质粒)减少一点,基本不会降低转染效率,一般六孔推荐10ul,我用过8ul,效果很好.最好转染后6小时换液.
4 还有感觉GFP对细胞还是有点毒性的.
祝你实验顺利!

8s5g[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢多谢~~谢谢大家
我按照大家给的建议换及时培养液再试试``
不过目前的质粒不是endofree的，我自己认为是这个原因
555~~~~

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

lipofectamine毒性很大，你用过其他试剂吗，像fugene6之类的

one[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先分析转染后细胞大量死亡的原因：
1.太多的脂质体/DNA混合物
2.细胞暴露于脂质体/DNA混合物时间太长
3.Cells are stressed.
a.转染后72小时内避免使用含抗生素的培养基
b.使用健康的传代细胞进行转染
c.避免转染细胞经常温度变动
4.细胞密度太低
5.靶基因是生存的关键基因

下面应用排除法逐一分析：根据楼上的资料，可能原因为2.细胞暴露于脂质体/DNA混合物时间太长 c.转染细胞经常温度变动，一般人不大注意。
另外，内毒素会影响转染效率，使大量细胞死亡值得探讨。此乃一家之言，仅供参考。

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