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标题:[求助]我的MTT这样设计对吗

研究僧112[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]我的MTT这样设计对吗



各位高手大家好，我刚开始做细胞试验，以下是我的MTT的实验过程，请大家帮忙指正，先谢谢了！
1.取对数生长期的细胞，消化制备细胞悬液，按照10000个/ml接种于96孔板上，外周的孔舍弃，只用中间的60 个孔。
2.孵箱培养12个小时，细胞贴壁后，加入干预药物，同时设置了空白组，对照组，给药组，具体如下：（1）空白组：完全培养液（不含细胞）100ml＋
用DMEM溶解的干预药100ml （2）对照组：完全培养液（含细胞）100ml+DMEM（不含药物）100ml （3）给药组：完全培养液（含细胞）100Mml+用DMEM溶解的干预药100ml 每组设置五个复孔。
3.培养24 小时后，加入MTT10ul，继续培养4小时后，离心5分钟，用注射器吸弃孔内液体，加入150ul的DMSO,震荡十分钟，上机检测。
我的问题是：1.我设计的空白和对照是否正确。
2.得到的OD值如何算抑制率
再次感谢大家！
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

药物浓度呢? 就用一个浓度?
最佳时间呢? 就用24小时?
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hold住[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人觉得楼主的设计不太合适，正如楼上所说实验药物要有不同的浓度，一般起码要有３种浓度，还有药物的作用时间，一般根据药物的性质选择，一般最少也要有３个作用时间，如24h,48h及72h.
空白组我觉得不用加药物,
抑制率= (1一实验组MTT检测OD值/对照 组 MT T 检测OD值)X1 00%
另外楼主的培养液的量应该写错了,不会是100ml吧?用注射器吸弃孔内液体也不太合适.
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

空白组就是调零孔，我认为不需加药物，只有无细胞培养液即可。对照组设计是对的。给药组正如上面各位所说的，应该设计不同浓度，尤其是第一次作某种药，又无可信的文献可参考时，浓度梯度应该跨大一点，以找到该药的作用范围，第二次作时，可在此范围内设计合适梯度，以便求得IC50。
抑制率的计算正如NOKSKY所写，如再精确一点，应该为：
抑制率= [1一（实验组MTT检测OD值－空白组OD）/（对照 组 MT T 检测OD值－空白组OD)]X1 00%
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发表于 2012-7-24 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想楼主应该是说100ul吧,整个培养体系就是200ul
楼主的空白组不晓得有什么用
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
空白组是调零用的，其实严格说也不算一个组，只是调零孔
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研究僧112[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位大侠指点，另外指出：1.我设计了五个浓度，2.笔误把ul写成ml 了，3.我确实只设计了一个时间点 4.不用注射器细用什么去除孔内液体呢 5.抑制率到底怎么算啊？这是我得问题得关键，我看了好多丁香园上得公式不一样啊，急切盼望高手得再次指点，谢谢！
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发表于 2012-7-24 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你不用吸管和tip枪的么?
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做MTT的具体方法是在细胞经过各种所需处理后（比方说损伤或加药后），直接在96孔板中加入MTT（储存液浓度为5mg/ml，使用时用PBS稀释，终浓度为0.5mg/ml）, 37℃，5%CO2培养箱内孵育 4-6小时，用扣板法将上清液弃掉（扣板法可能会将紫蓝色甲瓒颗粒倒出，所以也可以用枪吸出），然后加入二甲亚砜（DMSO）200ul/孔，轻摇培养板，使甲瓒颗粒完全溶解后，用全自动酶标仪波长为550nm测定OD值。
空白孔值就是所需减去的培养板的标底值，空白孔无需加入任何液体。
抑制率的计算正如NOKSKY、zhaozhao0104 所写。
抑制率= [1一（实验组MTT检测OD值－空白组OD）/（对照 组 MT T 检测OD值－空白组OD)]X1 00%
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-7-24 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主设的细胞与药物容积比为1:1,是不是药物太多了啊?大家是不是有这样的看法呢?
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