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标题:[求助]外周单个核细胞的分离培养

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]外周单个核细胞的分离培养


请教各位战友，我想先分离外周单个核细胞，然后做单相混合白细胞的培养。
分离操作步骤如下，请帮我看一下是否有问题：
1、无菌采集2份健康人静脉血各6ml肝素抗凝
2、各加PBS 6ml将血液稀释一倍
3、无菌条件下取淋巴细胞分离液14ml于玻璃离心管中
4、用尖吸管分别向对应玻璃离心管中加入稀释血液各12ml,未冲破淋巴细胞分离液的液面。
5、水平式离心机离心，2000rpm,20min.
6、用尖吸管轻轻插入中间云雾状单个核细胞层，沿管壁周围和云雾层吸出单个核细胞于离心管中，标记为G`，S`
7、分别于G`，S`中加5倍体积的PBS，混匀，离心2000 rpm,15min，弃上清；沉淀物中再加PBS,离心1500 rpm,10min.洗涤了2次。
8、洗完后，弃上清，留沉淀，S`中加入淋巴细胞培养液1ml重悬（此时会出现一些片状不溶物）
9、细胞计数
按照如此操作，分离外周单个核细胞这一步，在培养基中总是出现一些片状沉淀，外周单个核细胞的数量和活率也都不高。请各位大侠帮帮看看是什么问题
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们虽然没做过培养白细胞的培养，但PBMC的分离到做过不少。以下是我们之间试验中的诧异。或许对你有帮助：
1。稀释外周血采用HANK`S液，而不是PBS；
2。淋巴细胞分离液是不是有点多？不知道砍掉一半是不是更好？
3。水平离心时最好可以缓升缓降；
4。洗的时候都采用HANK`S液，1500rpm10min,共3次；
这样出来的细胞应该会好些。而你说加入培养液后出现片状不溶物，我想是不是细胞团没有吹开，或是你在吸取淋巴细胞层时混入了其他成分，或是还有什么别的原因，我就不知道了。
能说的就这么多了，不知道有没有帮助。 0票
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我看好多文献稀释外周血用HANK`S液，PBS，1640都可以
淋巴细胞分离液不是与稀释血的比例应该是1~2：1吗？
顺便问一下，你们在细胞计数的时候是在什么条件下？
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我很想知道您说的外周单核细胞的英文叫什么？
她和T细胞的关系是什么？
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

淋巴细胞分离液：稀释外周血＝1：2， 你弄反了。另外，转速不是固定的2000rpm，而是根据你的离心机转子半径而定，应该是500g。离心前分离液要预热到室温，平时壁光放在4度。离心时应该在20－22度的条件。如果血样放置时间超过3小时，离心时间增加到30min。
计数的条件无所谓。
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那我再试试，减少淋巴细胞分离液的用量，其他和您说的一样。不知道里面的那些碎片是什么?不知道有没有人碰到这种情况
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、淋巴细胞分离液不是与稀释血的比例应该是1~2：1吗？
顺便问一下，你们在细胞计数的时候是在什么条件下？ －－－－淋巴细胞分离液要看进口、国外的，国外的我用过1.5：1,国内的用过1：1，进口的我有做过1：1.5，国产的不行，做出来还不错。计数是在常温下计数板计数。
2、我们关键步骤离心条件是20度 400g 25min，结果也一直都不错
3、碎片估计是一些离心过程中受损死亡的红细胞碎片，对你的培养影响不是很大
4、你的单个核细胞数量核活力不足，首先你的血量太少，建议用到20毫升以上，活力不高，就要看你们试验过程离心机的离心力是多少，太大对细胞的损伤很大。建议你多注意下。
希望对你有帮助。有什么问题可以PM我。
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-7-25 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 淋巴细胞分离液过多，有点浪费。
2 离心力，一般ficoll分离时采用，900g20分钟，如果血液放置时间超过2小时，增加离心时间到30分钟。另外刹车时一定选择无刹车减速，虽然时间要长一些，但是相比分离效果来说还是划得来的。
3 片状物，从你描述上我认为是血小板，按操作时说，梯度离心后用HBSS洗涤单个核细胞时候，转速控制在400g离心可以去除血小板，但是在我们实际操作中发现，血小板去除效果一般，要看你实验需求是不是要去除完全，如采用，小牛血清法去除，效果较好。
4 细胞计数，在洗涤后重悬细胞后根据你实验需要的细胞浓度进行稀释，只要不是白血病等病人，健康人血液中正常操作，每ml可以得到1-2X106单个核细胞，你可以按这个大约比例来重悬细胞，取一滴来用牛鲍氏计数池来计数 ，条件允许的话可以用血细胞计数仪来计数，计数完后再添加液体使到你需要的细胞浓度。
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发表于 2012-7-25 11:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般来说，国内的单个核细胞分层液以上海试剂二厂的最常用，而且效果也不错，我们一般做的使用4ml的ficoll分层液，一般放在4度冰箱无菌保存，使用时需要复温至室温就可以了。
而且，我考虑与你的离心速度和时间有关，各个离心机的离心半径度不同，建议你摸一下条件，以找到适合你的条件。我们一般使用的是2000rpm，15- 20min,缓慢减速，建议你在这个基础上调试。
那些絮状的东西应该就是些血小板，你调整好速度和时间的话，应该就可以解决了。
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发表于 2012-7-25 11:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我正准备发贴问沉淀的问题,每次在记数后摇匀,配好悬液时确实可以肉眼见到不溶的沉淀,象粉尘大小.
如果碎片如楼上所说是一些离心过程中受损死亡的红细胞碎片,或者甲壳虫2 所说的血小板,我就放心了.

关于PBMC的分离我几乎每天在做,很不好意思,只昨天成功一次,隔夜没黄.我想可能是我无菌操作还待提高.另外还有几个问题想问:

1.分离液复温是在实验开始前只要放置在室温下,等待一段时间就可以了,还是在离心机上调 ?

2.每次离心后,我的白环还是很明显,但是我小心吸取后,再次离心时总是能看到红细胞,怎么能避免出现红细胞?

3.我是用的生理盐水洗细胞的,以前有人这么做过,实验也成功了,不知道有影响没?

4.关于分离液的比例,我用的是PPD还是什么类似名字的国产公司的.根据我的摸索,抗凝血(未稀释) : 分离液=1:1-1.5.因为如果稀释.血的容积会很大,分离液需要的量也会大,否则逐滴加入稀释后的血时,分离液将会受不起上面的重量.

5.我曾看过,说可以分离液往血里加,按上面的比例试过一次,加的时候看不出界面,离心后白环不明显,不知道还有谁试过没?
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