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标题:[求助]请教明胶包被96孔板的具体步凑

vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-7-25 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教明胶包被96孔板的具体步凑



我做细胞粘附，在96孔板上铺明胶，我一次要铺3张板，我已经用明胶铺了3回板子，铺了明胶放在37度孵箱里面孵了一个小时后拿到超净台里面将多余的明胶用移液器吸掉后，再风干，种细胞前用PBS冲洗一遍，可是不知道是何原因我的细胞每次在已经贴壁，而且有一部分已经变成梭形后，就死了。请给指点啊。
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-7-25 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我認為你的問題是在於細胞處理過程而不是明膠包被.
明膠包被應該是很簡單的工作, 不易出問題.
不過我倒是覺得你的包被做得太麻煩了.
我的做法都是當天做的, 鋪了明膠後放37度靜置1小時,
在等待的期間可以開始處理細胞,
接種細胞前, 把明膠溶液吸掉, 便直接加入細胞了,
根本就不需要用PBS沖洗, 因為明膠溶液中並不含有對細胞有害的東西,
用PBS沖洗只是多了一道無謂的手續.
另外不知你說的"用明胶铺了3回板子"是什麼意思...
是同一個培養板重覆鋪3次嗎?
鋪一次就夠了.
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-7-25 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢上面大侠的即时指教哈。
哦，我铺了3回板子就是每回要铺3张板子（是准备用来测定细胞在加药后12小时，24小时，36小时的黏附抑制率），铺了3回细胞都死掉了哦。
还有就是我的96孔培养板一次用了之后，没有扔掉，又反复消毒使用，不知道接种的细胞死亡跟这个有没有关系哦？但是我已经铺了3回共9张板子，其中铺那两回6张板子都是刚撤开包装第一次用的啊。到底是哪里出了问题哦？
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-7-25 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天铺的3张96孔板上的细胞今天早上看基本都快死光了，而昨晚细胞贴壁6小时后看细胞大部分都变成梭形了，幸好昨晚没有加单抗干预哦，不然单抗也就浪费了哦。
今天上午我又在3张自己泡酸等消毒处理的96孔板上铺明胶和接种细胞，我将细胞悬液重悬在25ml培养瓶中，用１ml吸管反复吹打约８０多次，我用移液器每接种一孔细胞都要摇培养瓶３下，使混匀，加完３张板子后，我在显微镜下观察发现最先接种细胞的板子上的每孔细胞密度均匀，而最后一张板子上的细胞密度明显底于前面的板子，而且细胞分散不是很均匀，难道是我悬细胞的培养基加得太少还是怎么回事啊？怎样做才能在板子上把细胞铺均匀啊？请高手指教啊．
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-7-25 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问明胶铺板的浓度是好大啊？我用的是2%，不知道浓度高不高？对细胞有没有影响哦。
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2012-7-25 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果實驗經費許可的話, 最好別重覆使用培養板.
如果你要回收使用的話, 消毒後要確實洗乾淨, 免得殘留物品影響細胞生長.

然後, 我是看你的細胞培養過程有些步驟有問題...
1. 你提到"用１ml吸管反复吹打约８０多次",
反覆吹打這麼多次是非常傷細胞的, 你只需要使用5 ml或10 ml的吸管,
吹打個數次, 不超過10次, 這樣就夠了. 另外吹打的速度不要太快,
太快也是很傷細胞的.
2. 你說"用移液器每接种一孔细胞都要摇培养瓶３下",
沒必要這麼頻繁, 因為細胞的沈澱速度沒那麼快.
你可以接種完一排(8孔或12孔)再吹打個一兩次就可以.
用吹打的效果才好, 用搖的不行.
3. 用96孔板本來就不易讓細胞分佈的均勻,
因為操作過程的振動都會使細胞聚集在每一孔的中央.
你只能儘快接種完, 然後直接放到培養箱去培養,
不要再用顯微鏡看.

最後, 鋪明膠的濃度是0.1%, 你使用的濃度是明膠母液才需要這麼濃的.

看你的敘述, 我是覺得你培養細胞的過程中做了過度的工作,
又用顯微鏡看每一孔, 導致操作過程變得很長,
這樣細胞就會受到很大的損傷, 就會養不好.
你先試試養在其它比較好操作的容器,
等到細胞養得起來, 再來試96孔板.
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-7-25 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上面大侠说得太好了哦，但是昨天我又铺板了到今天已经过了24小时细胞长势还不错，明胶还是用的是2％，我今天就加了单抗干预，细胞应该不会死了，不过我还是非常感谢你的细心指教。我还要做细胞的增殖，也是在96孔板上，下一步我就按照你的指教吹打接种细胞。细节太重要了，你真的是太好了，能这样详细的给我指点哈。再次感谢哦。
最后再问一个问题就是我用这样高的明胶浓度做MTT测细胞的粘附，不知道能不能在毕业论文上这样如实的写呢？我明年就毕业了哦。
还有就是我的空白对照孔是只加的RPMI1640培养基，请问做MTT时需不需要跟实验孔及没加药的对照孔一样也需加MTT20ul，过4小时加DMSO后再去测OD值呢？
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vivian4123[使用道具]
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 小中大
我配制的2％的明胶溶液是用PBS配制后拿去高压灭菌后放在4度冰箱里面的，用时就拿至超净台直接铺在板上，每孔加了约30ul,再放在37度静置一小时后拿出来吸掉多余的明胶，再接种细胞，我这样配制及使用明胶的方法有没有问题啊？
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vivian4123[使用道具]
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 小中大

请及时指教啊，今晚我就要加MTT了哦。非常非常感谢哦。
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发表于 2012-7-25 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

使用2%的明膠應該也是可以, 只是比較浪費(我是沒試過濃度會不會影響).
至於要不要在論文裡明確指出明膠的濃度,
那就看你要不要寫的那麼細了.
基本上我認為你寫出來口試委員可能會問,
但應該也不至於到不讓你過關的程度,
因為你的論文重點不在這裡.
當然你也可以只寫"用明膠包被過的96孔板"來帶過...
另外, 做任何實驗都需要空白對照組的, 就照你寫的那樣做吧!
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