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标题:[求助]基因转染后如何稳定筛选

fqswdzd[使用道具]
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发表于 2012-7-26 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]基因转染后如何稳定筛选


我用pcDNA3.1构建目的基因重组质粒，LipofectamineTM2000转染大鼠的NRK-52E细胞，转染前用GFP荧光蛋白转染发现转染效率比较好。目的基因重组质粒转染3天后加G418 500ug/mL，6空板中到14天仅剩几个细胞，而且状态不好，到17天细胞全部死亡。而同时转染的空载质粒细胞却大部分存活。请高手指点，实验中有什么问题，下一步怎样改进，多谢！
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-7-26 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是新手，跟你分享一下自己的感受！
建议先用G418进行浓度梯度培养正常的细胞，观察细胞生长状态，选择细胞可以耐受的浓度进行转然后的稳定筛选。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好看到你提到“用GFP荧光蛋白转染发现转染效率比较好”，想请教一下，你是按照invitrogen的LipofectamineTM2000的使用说明书进行操作的吗？我用六孔板转染了好几次，24小时，48小时及72小时均看不到任何荧光，不知问题出在那里？
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在转染前我已用正常细胞筛选到14天全部杀死细胞的最低G418的浓度为500ug/mL。GFP荧光蛋白转染是按invitrogen的LipofectamineTM2000的使用说明书进行操作的，1ug:2ul、1ug:4ul两种比例，24小时到36小时荧光很清楚。nency_ren2004 看不到荧光，是不是你的细胞和转染试剂的效率问题，我也不太懂，等高手解释。
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toy[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

阴性细胞由于没有变异的压力,生命力要强于阳性细胞,所以在不加G418下培养阴性细胞生长情况远好于阳性细胞,因此及时快速加入筛选试剂有利于阳性细胞的生长,转染后10-18小时内加入G418,是最好的选择.
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HP007[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

考虑主要以下原因:
1.转染后没有及时加药进行筛选,如楼上有人所说．
　我们是这样做的：第一天分细胞－第二天转染，转染后５小时换液－第三天加药筛选．
２.转染有问题．GFP荧光蛋白转染效率可以不代表你质粒转染效率高．质粒的纯度等都有可能出问题．
３.或是你的基因起作用啦？空载活的很好嘛！
　我们实验室用pcDNA3.1构建目的基因重组质粒LipofectamineTM2000转染效果很好，未出现上述问题．
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是的质粒没构建好，重新检查一下你的目的基因和新霉素抗性基因的构建情况。不可能阴性对照细胞不死啊，你的空质粒是什么质粒？你可以对没有任何处理过的细胞加G418 500ug/mL筛选，看结果怎样。
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢诸位的指点，我已按照你们提的意见重新做转染
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于转染后的筛选我也做了很久了 一直没有成功 。目前我总结了一些自己的想法 打算再做一次。不论对错 希望可以对大家有所帮助。
1 技术已经很透明了 所以要有信心
2 保证质粒提取 就是说以一定要自己鉴定一下 跑电泳 做酶切。我的质粒是 师姐构建好的 所以自己一直没有鉴定。
3 转染大家基本上用的都是脂质体2000 就没什麽好说的了。有一个方法可以试一下 就是原来不是在转染后4－5小时换掉无血清培养基吗。有老师建议我这个时间延长，这样可能转染时间延长的同时 转染效率提高， 有丝分裂延长，筛选更容易。
4 G418筛选浓度一般在400－600之间 我个人认为 我的细胞我做了两个浓度 400 和600 建议在细胞大量死亡的时候要及时降低浓度 半量维持吧。
5换液一般3－5天 我是一星期两次。强调的是一定动作要轻柔 不要吧本来状态就不是很好的细胞吹起来。
我总结的就是这些了。 打算再做一次。 我相信可以成功。同样祝福大家！
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2012-7-26 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有个问题请教，脂质体转染24h后消化以1：10稀释到96孔板上，再过24h后加G418筛选，还是在６孔板上先加G418筛选后挑单克隆？请高手指点！
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