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标题:[求助]如何做稳定转染以及如何预实验确定G418浓度.

pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-7-26 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何做稳定转染以及如何预实验确定G418浓度.



本人已经成功培养脂肪间充质干细胞，现打算做稳定转染，质粒市现成的，含有neo耐药基因，转染后需要G418筛选单克隆，不知道各位是否有成功的经验，G418用多大浓度的？如果做预实验不知道如何筛选浓度？还有稳定转染怎么做啊？人本菜鸟一个，希望大虾指导。谢谢
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guagua[使用道具]
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发表于 2012-7-26 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

G418的浓度是根据细胞杀死曲线选择的，细胞正常传代如24孔板多设定些孔，保证每孔细胞基本相同。同时设不同的G418浓度加入细胞，观察生长情况，选择在第6-7天能把大部分细胞杀死，12-14天内全部细胞死亡的G418浓度，用该浓度进行筛选。
筛选要维持4W左右，看到有单克隆细胞生长后，用克隆环局部消化转种到96孔板，然后逐渐扩大48-24-12-6孔进行培养。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-7-26 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的帮助,不过不知道筛选G418浓度用的细胞是还没进行转染的细胞还是已经转染完的细胞?
关于稳定转染有没有什么相关的书籍或者资料文献可供参考的,请推荐一下吧~~~谢谢.
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2012-7-26 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我现在也在作稳定转染，G418筛选二十天了，现在有单克隆形成，请教哪种方法挑选单克隆比较好，先谢了
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-7-26 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，能否把你实验的大致过程（G418浓度的选择和稳定转染的步骤）发表一下吗，谢谢啦~~~~
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-7-26 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
418的浓度是根据细胞杀死曲线选择的，细胞正常传代如24孔板多设定些孔，保证每孔细胞基本相同。同时设不同的G418浓度加入细胞，观察生长情况，选择在第6-7天能把大部分细胞杀死，12-14天内全部细胞死亡的G418浓度，用该浓度进行筛选。
筛选要维持4W左右，看到有单克隆细胞生长后，用克隆环局部消化转种到96孔板，然后逐渐扩大48-24-12-6孔进行培养。

————————————————————————————————————————————————————————————————

非常感谢,想请教一下24孔板做预实验确定浓度的话，细胞的密度如何确定,大概要求覆盖率达到多少?还有G418的浓度剃度具体是怎么定的呢,跟文献报道的筛选浓度之间一般是怎样的关系?谢谢啦!
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发表于 2012-7-26 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问，哪里能买到你所说的克隆环啊？
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-7-26 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

挑选单克隆的优化
为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除发结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。
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发表于 2012-7-26 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问以下面的方法测定G418浓度是否可行：
细胞铺于96孔板，设定不同孔的G418浓度，并加入MTT，分别于三天，五天，七天，九天，十一天，十三天，十五天的时候用酶标仪来测定OD值，最后通过换算公式（具体还没查到，不过据说有）换算成细胞的死亡率来最终确定G418的浓度。
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发表于 2012-7-26 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚做完我的G418浓度梯度实验，具体方法：1，第一天将生长期的未转染细胞消化，计数，使之达到10000CELL/ML，铺24孔板。至于铺几孔要看你要测多少个浓度。我是：0，200，300，400，500，600，700，800，900，1000（UG/ML）；2，第二天待细胞贴壁后（我的是贴壁细胞）加配好的G418，使之达到相应的浓度，37度，5%CO2，孵育；3，每天观察细胞，G418一般3天换一次；4我的细胞从第三天开始400以后的就有逐渐增多的细胞死亡，至第七天400的孔基本无存活的细胞。
我打算就用400ug/ml的浓度筛选我的转染的细胞。
希望对你有帮助！
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