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标题:[求助]提取细胞蛋白时的一些粘稠物质

kewanqi2011[使用道具]
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[求助]提取细胞蛋白时的一些粘稠物质


我提取细胞蛋白时做法如下:
PBS洗两次,胰酶消化,收集到1.5mlEP管,PBS洗两次,加入蛋白裂解液(RIPA),并按比例加入蛋白酶抑制剂,在放置于冰上30分钟,最好是隔一小段时间就轻微振荡一下管子,以求充分裂解,然后再高速离心。收集上清。-80度保存。为什么每次,裂解以后总有粘稠物质,离心也无法沉淀。请高手指教!
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kewanqi2011[使用道具]
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考虑是不是核酸,裂解时加入核酸酶可以避免吗?可是很多人都是不加核酸酶的啊
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redbutterfly[使用道具]
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细胞裂解完之后就是很浑浊的啊,你指的粘稠是不是就是不太清啊,如果你的蛋白浓度很大的话那可能看起来就是很粘稠了,我想你应该测一下蛋白含量,或把你裂解后的样品稀释一下,如果不那么浑浊了,那就是这个原因了吧。
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kewanqi2011[使用道具]
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是因为蛋白浓度太大的缘故吗,我想不会吧。那些粘稠的东西,是像鼻涕一样的东西,有时候用枪头都很难吸上来。
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guagua[使用道具]
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首先,这物质是核酸。核酸会导致明显的粘稠(能拉成丝)。蛋白如果想变得粘稠,似乎至少要5% (w/v)以上才会有一点……那是50mg/mL了吧?所以蛋白要想粘得那么厉害,不知道要多浓了。

其次,解决粘稠的方案有如下两种:
1. 超声断裂核酸。 只需要不大的超声功率,断时间内就可以消除粘稠。具体实验室的方法不同,但原理相同。需要自己摸索条件。这个办法挺好。
2. 将粘稠的蛋白匀浆置于沸水浴中。我的经验是,5min后明显缓解,10min后完全解除粘稠问题。这方法也不错。

如果还有别的方法,愿闻其详。
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guagua[使用道具]
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By the way,核酸酶效果不好。因为裂解液中应该会有一些使蛋白变性的成分,核酸酶也难免受影响。我试过,效果不佳。
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kewanqi2011[使用道具]
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可是我们实验室没有超声啊。
我加入上样buffer沸水中煮5min后,还是有那些粘稠的东西,怎么办?我是说在提取蛋白的时候就加入核酸酶,效果也不好吗?
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ha111[使用道具]
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8
 

提取蛋白的时候难道没有变性剂么?RIPA里面有SDS,有NP-40等等……

我直接加1%SDS in PBS到Dish里面,用细胞刮子刮,完了煮10min,挺好。最多就是在PBS里面加点蛋白酶抑制剂片剂,其实估计也没必要。SDS抑制酶活效果多好啊!呵呵!
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kewanqi2011[使用道具]
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我是六孔板里加30-40微升裂解液 是不是太少了
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10
 

你根据之后蛋白定量的情况和实验具体要求来看吧。
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