[求助]MTT法为何看起来不是很准?

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标题:[求助]MTT法为何看起来不是很准?

kulee[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的u251细胞，接种96孔板为1.5x105 cells/ml,几种抗肿瘤药物均按的c=20d计算公式得到药物浓度c值，分为0.1xC C 10xC 3种浓度，每个浓度3个孔，20ul药物溶液加入180ul悬液中培养然后44小时后加入mtt溶液共培养4小时，后面再加DMSO测量。不知道为什么有时低浓度的药物细胞抑制率竟然为负，而有时同种浓度的药物3个结果相差也会比较大，重复做一次实验发现更是变化巨大。难道mtt重现性如此之差还是我的做法有问题，希望有做过的一起交流下经验。不甚感激。

yes4[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做过很长时间的MTT,总体感觉结果还是比较稳定的,鉴于你的描述我感觉:
1.不同孔间差异大有可能和接种不均匀有关系
2.不同批次的实验差异大是否和计数误差有关系
3.低浓度的药物细胞抑制率竟然为负这也是有可能的,实验本身就允许有一定的漂动.
4.建议:在接种时注意将细胞悬液充分吹匀,接种的十孔后再吹一次
可以先做个预实验,接种梯度浓度的细胞,看看MTT的结果是否有线形相关,多做几次就可以掌握实验过程中的诀窍了

祝实验顺利

toy[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的情况跟我前几天做的情况差不多，也是有负值并且同一个浓度的三个孔相差也较大。我总结了下大致原因是孔间的差异肯定是细胞浓度加的不准，加细胞前吹打30－50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候隔几个孔重新吹打并且加每个孔前摇几下（每次摇的次数最好相等）这样就基本能解决加细胞不准的情况了。

HP007[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也感觉MTT实验重复性很差，我做的结果复孔之间的方差很小，OD值如果是0.8，几个复孔基本都是，自我感觉细胞计数的问题不是很大，但是两次重复实验的结果正好相反，一次是高浓度促进增殖，一次是低浓度促进增殖，很郁闷，希望大家多多交流。

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MTT本身就是一种重复性很差的试验，国外文献有些已经不用来检测细胞活力，现在又改良的试验方法，如SRB，CCK-8，XTT等。但是作为一种经典的方法仍然在使用，毕竟对于很多试验室简单易行。我觉得最重要的是细胞接种一定要均匀，否则后面无论怎样操作都无法减少误差。我的经验是取一个消毒好的广口瓶，大约50ml左右吧，用来盛稀释后的细胞悬液，然后反复吹打均匀后，用1ml枪头分装到多个消毒好的青霉素的小瓶中（根据你的试验确定分装的个数），每吸一次吹打3次，保证每个小瓶中的细胞数一致。接种细胞时，尽量一个青霉素小瓶接种一块板（小瓶体积约6ml，按每孔100ul计算，可接种至少50孔，因为吹打的时候会产生气泡，因此不会刚好是60孔）。每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。如果每板为一个时相点的话，那么每板都用一个小瓶中的细胞接种，这样就保证至少每个时相点的细胞数目是一致的，尽管不同的时相点之间可能会有少许差异，但是这并不影响试验结果。总之，我用这样的方法至少能保证4个正常组的平行空和4个对照组的平行孔间在OD值上只有百分之五以内的差异。
向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。

在加药的时候，我觉得还是应该用新鲜的培养液加入药为好。因为如果做到72h，那么从接种细胞开始实际就是96h了，不换液的话其实是不好的。
另外我做MTT的时候也走了很多弯路，主要是加药的时候，我的药溶解性不行，刚开始没有发现，后来才发现这个药不能均匀的分散在培养基中，一定要每加2孔都反复的吹打，才能使药均匀分散，这样才能使得每孔确实加入了你预订的药物量。我甚至使用了涡旋振荡仪来使得药物能在培养基在中均匀分散。所以做MTT的朋友一定要考虑自己每孔中是否真的加入了那么多的药，是否真的达到了你设计的浓度，否则永远也不能得到一致的结果。

KGZ564[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上的说的很不错，我想绝对是做了很多次才得出的这些宝贵的经验！总结得挺好的！MTT我也做过很多次，也写写我的心得
MTT法的原理：
黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

取对数生长期的细胞，用o．25％胰蛋白酶消化细胞，终止消化离心
1．细胞计数
计数板和盖玻片需75%酒精擦拭，绸布拭干或晾干，如玻片不干燥会影响镜下观察效果。
计数前a.需将待测细胞悬液吹打均匀（轻轻吹打100~200次），b.要求悬液中细胞数目不低于10000个/ml，如果细胞数目太少需进行离心再悬浮于少量培养液中；以上两者均可影响细胞记数的准确性，
取少量细胞悬液至计数板――方法a.吸管吸取细胞，让吸管在计数板一侧的凹槽处流出液体，至盖玻片被液体充满为止，不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡方法b.100ul的移液枪吸取20ul细胞悬液至计数板边缘，液体经虹吸作用进入凹槽；
静置半分钟；
数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。
操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
记数后计算细胞总量，（4 大格细胞总数 x 104 / 4= 细胞数/ml）。
经适量稀释后准备种板

2．细胞种板
细胞种板前，应在离心管内充分打匀，以保证每孔接种细胞量接近，每加几孔就重新吹散一次（一般加一到两排孔就重新吹散一次），否则，每孔细胞浓度就会不同。且这个过程要小心避免污染。所以操作需熟练、争取快速种板。

1）选择适当的细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板每孔贴壁细胞长满时约有10万个。但由于不同细胞的面积是有差异的，因此，在进行MTT试验前，应做相应预实验，绘制细胞的倍增时间以及不同接种细胞数条件下的细胞生长曲线，确定MTT试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证在整个MTT实验当中即保证培养终止时细胞不致过满。这样，才能保证MTT结晶形成量与细胞数呈良好的线性关系
2）避免血清干扰。
用含15％胎牛血清的培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。这样会影响试验敏感性。因此，一般选小于l0％胎牛血清的培养液进行。（按照具体实验而定，也可以用无胎牛血清的培养液作为细胞生长的外环境），在加入MTT溶剂呈色后，应小心吸净培养孔内残余培养液，不要吸走沉淀物，之后入加DMSO比色。也可使用翻转法，将孔内培养液直接倒掉。

3）对照组的设置。
建议96孔板的第一纵排设置为不加细胞只加培养液的空白孔，第二纵排设置为只加细胞和培养液不加干预的细胞对照组，其后的纵排作为加药物干预的实验组，其它试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。

96孔板最外层一圈的孔可做空白对照，但不要养细胞，否则这些孔得出的实验数据可能会偏高或偏低，原因是温度和湿度对周边孔内水份蒸发影响最大，水分的蒸发就会影响每孔内干预药物的浓度（对实验结果影响较大），同时水分蒸发也会导致各个孔内细胞的培养环境出现差异。（此现象被称为边缘效应，值得注意。）方法是：a.保证培养箱内湿度在标准范围（定期检查孵箱内的水盘）b.实验各复孔尽量设置在96孔中央，减少水分蒸发对实验的影响。

3．加MTT：
MTT有毒性，操作时应注意防护。
(MTT溶剂需避光4度保存，配好的溶剂有效期两周，过期的不能再用于实验，须重配)
之前设置好实验的时间梯度，在每个时间点时终止细胞培养，每孔加MTT溶液(5mg/ml)20μl,于37℃，5%CO2 条件下孵育4小时。
]
4．加 DMSO
MTT呈色后小心吸取各个孔内的液体（可用翻转法），镜下观察细胞已不见原有形态，呈针状向四周散开。
之后每孔加DMSO150μl显色，室温下置于摇床上10分钟以充分溶解甲臢。如果实验孔不多，DMSO加入后可以用枪头吹打混匀，比振荡溶解效果好。

5．吸光度（A）测定：
用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为490nm，（可能各个实验室的测定波长会有不同，具体情况而定，这里就不表了）记录实验结果。以时间或干预药物浓度为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

ROSE李[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对了请问楼上的朋友，mtt是溶解于培养基还是d hanks液？

TAT[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我门溶解在无血清的培养基中，请问有做SRB的吗？？MTT我们也做了很多次，感觉铺细胞的确是最终要的。

dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。
3）如果不使用96孔板，培养基超过100 ml，MTT按照10%的比例加入。
4）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。
5）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，570nm有最大吸收值，并且建议以630nm作为参考波长。
6）96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，边缘孔用无菌水填充并要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。
7）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。
8）没有去掉上清直接加DMSO，沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，1000r，5分钟，然后吸掉上清。加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。
9）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。
10）除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。