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标题:[求助]MTT法的96孔四周

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]MTT法的96孔四周


看到很多讨论说 96孔四周不做数据处理，那么还是要加细胞或培养基吗？如果我把四周设为空白孔（不加细胞）作为阴性对照，可以用来调零或计算抑制率不？
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的做法是把96孔板的四周都加少量培养基
（可以是不含血清的，省钱^_^），但不作为实验用空白或阴性对照。
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可用只加培养基组作为正常对照组,来计算细胞生存率=给药组MTT/正常组MTT×100%,余空可不加任何物质.　　MTT不同与做ELISA需要设立空白对照、阴性对照和阳性对照,这其中的空白对照一般用PBS,目的是去除板底效应．
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那四周的孔，在酶标仪测定时设为什么孔呢？空白、对照还是样本？
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养的肿瘤细胞，最近我用胰酶消化常常不能消化成单细胞悬液，以前都不是这样的，有哪些可能会这样呢？胰酶中加EDTA是否会好些？
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ending[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的，不知道你养的是什么细胞，也不知道你加的胰酶有多少，我的细胞从300UL到2ML不等，要根据情况来调整。时间大约都在3分钟左右。我想一般的肿瘤细胞还是挺好消化的。 加EDTA确实可以使消化容易些，但色影像细胞贴壁， 所以一般我们都不用。
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yychen[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实际上，对于96孔板的细胞培养可以采取一个方法来改变出现误差的情况，就是将你的分组打乱，不要让你同一组的细胞集中排在一个区域，尽量打乱，就可以了
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上说的也真是一个好办法！
再问问：我同学用重复使用的96孔板，他测过说什么都不加空白时，每个空相差比较大。这对结果有影响吗？
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HPLC使者[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

96孔板最好是一次性使用，而且进口的质量要好得多。我们实验室以前都用costar的。重复使用必然要做无菌处理，对板底部多少会造成影响，从而影响实验的准确性和结果的可信度。质量不好的孔板要是重复使用的话细胞接种后有可能都活不成了呢。
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-7-28 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于楼上的这个问题，我个人的观点是：

首先，分析原因，即必须知道在96孔板四周做数据处理会有什么影响？

因为96孔板的密封性比较良好，也就是说培养箱内空气中的O2是透过板四周很小的空隙进入培养板的，细胞代谢产生的CO2也是通过四周空隙从板内排出来的。在板内外气体交换时，37度条件下，板内的水汽也被大量带出板外。这样，就会造成96孔四周孔内的体积减少，如果细心一点，就会发现外外周孔内培养基的体积明显小于内部的体积。因此，如果最外一周有细胞进行培养，则会因培养基成分的浓度偏高而对细胞有影响，同时也会因为体积变化在做加入药物干预实验时，药物浓度偏高而对测定结果有影响。

因此，在具体操作时，可以采用以下对策：
知道原因，我们可以跟据实验情况选择PBS或D－Hanks溶液，因为外周加入这种成本低廉的溶液，一方面可以减少内部各孔中细胞培养液中水份的损失，另一方面，可以做为分析染菌等突发事故的原因，进行排查，找到染菌源头。当然，因为作MTT时，你本身会做空白对照与阳性对照，所以你可以完全不用管本底带来的误差了（建议你采用中间列6个孔为空白对照组，剩下共有9组54个孔，正好可以做三个药，每个药可设高、中、低三个浓度；加细胞时，你采用随机加细胞法，反正60孔细胞你加满就可以放心去培养了！）。
祝实验顺利！
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