[求助]dna ladder 失败

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标题:[求助]dna ladder 失败

了了[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做了两次了，一次是自己手提的，一次是用提基因组的试剂盒提的，都是在预期的凋亡组出现smear,但并没有ladder，但是泳道三（左起第三道）师兄用进口试剂盒作出来过ladder，郁闷，不知为何，请高手指教。大家帮忙呀。

附件

2012-7-28 17:01

79078330.jpg (17.59 KB)

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的ladder也总是做不出来，可以问一下你的胶的浓度是多大吗？还有你的跑胶时的条件。因为我的样品有时连上样孔都跑不出去。

了了[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是1。8－2％的胶，50V,4小时

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的胶浓度太大了，用1.5%的，40V，6H试试！
还有你的琼脂糖是哪个公司的啊?

了了[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢“我爱我的选择”的战友的回帖，我用的是西班牙产的琼脂糖，我觉得质量还行呀，有什么问题吗？

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你们的方法是什么杨的阿？发个具体步骤吧，我们用一种裂解液可以富极小分子DNA，一般豆可以做出来，跑胶要用小电压跑5小时左右。

guagua[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发一个我的实验步骤：
实验步骤;
1.  收集细胞，
2.  加入lysis buffer (每106个细胞加10ul，最少50ul)，离心1600g，5min，吸出上清，剩下的pellets加入lysis buffer重复上述步骤。合并两次supernatant
3.  加入10％SDS 使其终浓度达到1％
4.  加入RnaseA（终浓度5ug/ml）,2h,56度
5.  加入蛋白酶K（终浓度2.5ug/ml）,2h, 37度（或过夜）
6.  加入1/2体积的 10mol/L 乙酸铵混匀（上下颠倒几次，不可振荡，避免剪切力）
7.  加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇沉淀，充分混匀，－20度放置30－60min。4度，12000rpm离心15min。吸出上清，于室温将开盖的eppendorf管将残留的乙醇挥发干净， TE缓冲液溶解。
8.  每5ul DNA溶液加入Loading buffer 1ul，于2％琼脂糖凝胶电泳。

我用的方法，DNA ladder是不太容易出结果。从细胞形态上看已经出现明显的变化，但是收集细胞的条带不理想。我个人觉得你的那个还不太算是smear.我也是做了2个月才跑出可以用的条带。
祝你好运！

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

DNA Ladder 测定
　　方法：收获细胞（1X107）沉淀，细胞裂解液，13000rpm′5min,
收集上清，1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h，蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜，14000rpm′15min，最后将沉淀溶解在TE buffer中。
琼脂糖凝胶电泳

1)将5×105细胞移人无菌的1.5-ml Eppendorf管中，4℃ 2000 r／min离心5分钟，弃上清。
注意不要使用过多的细胞，否则随后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。
2)加入20µl溶解缓冲液[20 mmol/L EDTA，100 mmoll/L Tris，pH8.0，0.8％(w/v)
SDS] 。用移液管尖混匀细胞沉淀。
小心：SDS(见附录5)
不要形成强的旋涡，因为高分子量DNA可能被剪切。
3)加10µl RNA酶A/T1混合液(分别为500U/ml，20000U／ml，Ambion Inc．)，轻弹管尖混匀，不要形成旋涡。37℃孵育30-120分钟。
4)加10µl蛋白酶K(20mg/ml，Ambion)，轻弹管尖混匀，50℃孵育至少90min，也可过夜。
5)加5µl 6×DNA加样缓冲液(30％甘油，0．25％溴酚蓝)，在含0.5µg/ml溴化乙锭TAE的1％-1.5％琼脂糖凝胶干孔中加DNA样品。
小心：甘油；溴酚蓝；溴化乙锭(见附录5)
为了避免由于某些制备液黏稠而致DNA样品损失，推荐加样应在干孔中(电泳池中加入缓冲液之前)。参考加样量为100bp大小。
6)低电压电泳，可以促进DNA片段的分离(如35 V，4小时，或至染料泳动到2/3处)。
7)DNA序列梯最后有紫外光显示，摄影。凋亡细胞形成明显的DNA梯度，而坏死细胞为不清晰的成片条带(或无DNA裂解)。活细胞DNA在胶顶部，是一个高分子量条带。
凋亡并不都能形成梯度，这取决于所研究的细胞类型。另外，坏死细胞在某些情况下能产生梯度。
凋亡中如发生DNA裂解，通常会失去膜整合性。如因生存力丧失梯度形成明显迟缓，则不像是凋亡发生。
注意事项
•建议使用宽口移液管移取基因组DNA，以避免DNA的剪切。宽口吸头可从商业途径获得，或将200µl吸头尖切掉而制得。吸头应高压灭菌，避免DNA酶污染。可以不在琼脂糖凝胶中直接加入溴化乙啶，而是电泳后用含1µlg/ml溴化乙啶的TAE缓冲液染1小时，用水脱色后进行DNA显色。

这是老师给的大概步骤，不知对你有没有用，其实好多细节还是要靠自己摸索，祝你实验早日成功！

toy[使用道具]
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发表于 2012-7-28 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Ladder实验是检测细胞晚期调亡的,而且其晚期调亡率需要达到一定的比率才有可能在你的电泳中出现明显的阶梯条带,一般有的文献报道晚期调亡要达到30才出现很明显的LADDER,但也不定,我做时个人认为如果能达到15%左右的晚期调亡也会出现较为明显的梯状条带.所以如果你的细胞只是有早期调亡或是虽然有晚期调亡但是晚期调亡率很小没有达到一定的比率是很有可能出不了典型的LADDER的,即使你的步骤很正确,所以还要看你的细胞晚期调亡率是否达到一定的比率!

了了[使用道具]
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小中大

多谢大家的帮忙，经过三次实验，终于成功了