小中大[求助]抗低糖低氧对培养心肌细胞损伤的药效试验
中药xx抗心肌缺血的作用及机制(在心血管版发过了，但是没有人回复,只好找到细胞版再次求助了，望斑竹和战友见谅,真的是由于实验太久没有进展,急啊!)
各位战友，我在进行一个项目，如题中药xx抗心肌缺血的作用及机制，药物的动物实验都做过了(包括犬冠脉结扎测定梗死面积,大鼠离体心脏灌流,还有心肌耗养量实验等)，结果也已经拿到，我现在的任务是想在离体原代培养的大鼠心室肌细胞上建立缺氧缺血模型，进行药物作用机制的研究，现在的问题是，我在细胞模型上怎么也作不出药效来，就连阳性药物也是如此，现在我把实验过程简述如下，请各位多多指教：
1. 细胞的分离：
取初生24h的SD大鼠，无菌条件下剪取心尖组织，充分剪碎后用0.1％的胰酶和0.1％胶原酶消化的方法获得单细胞悬液，差速贴壁法一小时取上清，获得心肌细胞，在含有Brdu的DF12培养液中培养待用
2. 缺氧缺血模型的建立：
24h后将细胞培液更换成无血清的DF12（此时没有Brdu）后放入自制的双层带循环水的有机玻璃盒子中，采用抽气，并灌入95％N2和5％CO2的混合气体，多次交换后获得一个低氧环境，缺氧一定的时间(无糖,无血请培液作过2,4,6,8h, 无血清作过8,12,18,24,36h,完全培液作过24,48h)，期间还不断的通人混合气体（速度很慢）。完成后测定细胞的存活率。
3. 药物与对照：
缺氧前更换培液时就同时加入待测药物（浓度梯度）和阳性药物(丹参注射液,阿替洛尔,卡托普利等)，缺氧完成后我是采用MTT的方法来测定细胞的OD值来间接反映药物是否对心肌细胞有保护效果
