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名称：两步原位灌流法分离肝细胞
步骤：1、将小鼠拉颈处死，用大头针固定于手术台。
2、75％乙醇对腹部进行消毒，打开腹腔，用大头针将腹部的皮肤固定于身体两侧，充分暴露腹腔。
3、找到门静脉，将头皮针插入门静脉，用手术线固定头皮针。吸取10ml肝脏灌流液从门静脉注入肝脏，可观察到肝脏变白膨胀，剪断下腔静脉时肝脏冲洗后的液体从下腔静脉流出。
4、肝脏冲洗干净后，注入5ml胶原酶V，室温原位消化肝脏10分钟。
5、将肝组织剪成小块至于5ml 0.02％的胶原酶V中，37度消化30分钟。
6、用胶头滴管反复吹打挤压肝组织使肝细胞分离脱落。
7、将细胞悬液吸至灭菌的玻璃离心管内，加5ml DMEM完全培养液终止消化，800rpm离心5分钟，可见白色的肝细胞沉淀。
8、吸取上清，滴一滴于载玻片上，镜下观察可见全是组织碎片而无肝细胞。
9、将上清弃掉，加加5ml DMEM完全培养液悬浮肝细胞，800rpm离心5分钟。如此反复清洗肝细胞去除组织碎片。
10、将纯化后的肝细胞加入10ml DMEM全培养液，至于10cm板37度培养。
肝细胞分离后一定要进行胎盼兰染色，检测分离细胞的存活率，您的细胞大部分不贴壁很可能是因为细胞都死掉了，机械分离法对细胞的损伤还是很大的，细胞分离好了大部分是可以贴壁的。
