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标题:[求助]流式测小鼠细胞凋亡图片请教

remenb[使用道具]
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[求助]流式测小鼠细胞凋亡图片请教



我用Annexin-V/PI染色方法上流式检测细胞凋亡情况,见图,骨髓细胞FITC+/PI+双阳性细胞里怎么明显的分为两群啊,补偿调过了还是这样。脾脏细胞的就没出现这样的情况。请问表示什么意思?还有,这样划线分四区域可以吧?


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2012-7-31 13:11
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阿司匹林[使用道具]
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应该是补偿调节的问题,我想右上的两团应该分别属于左上和右上!
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hot_hot_hot[使用道具]
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如果你确定补偿没问题,那请你考虑骨髓细胞的异质性问题。
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remenb[使用道具]
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补偿反复调过了的,没有什么变化。按你的意思重新划分的话,那2群细胞分属左上和右上,那左上一群是什么呢?比例也太大了吧。附上例图,右边是没加抗体的空白对照。


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fei1226com[使用道具]
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不是太明白您说的“补偿反复调过了的,没有什么变化”!因为在电压调整适当后,补偿是非常灵敏的,轻微变化即可引起图形变化。
您问的问题很好,左上角是什么?
我没有从书上找到答案。但也从许多地方见过很多种说法。总之,可以认为,它在凋亡和坏死中意义不是很大(这样说似乎不严谨,但现在我只能这么说),也许是裸核,也许是正常细胞粘上了含PI的DNA,也许是binding buffer有问题,Annexin V连接PS不好,也许。。。。。我自己分析也许是这些原因,(请各位指教!)
从您的空白对照直方图看,阴性对照的确不该在散点图的10^2以上,但是,补偿不恰当就有可能两个图不吻合!因此,个人意见还是:补偿不恰当。
个人意见,欢迎版内高手指点,批评!
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remenb[使用道具]
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呵呵,我说的补偿没变化是指在可调范围内PI阳性的细胞还是分成明显的两群。
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你的补偿和电压都有点问题,你应把FL1的电压调低,加大FL1-FL2的补偿。在整个实验开始前你要调整好你实验的补偿和电压,仅仅用未染色的细胞时不够的。你要分别制备ANNEVXIN V和PI单染的细胞来调整补偿。
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plaa[使用道具]
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若重新调整补偿,左上的部分是机械作用破坏的细胞,即在处理过程中破坏的。
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star#room[使用道具]
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真要搞清楚也不难,重新测一下。用你试剂盒中的试剂,单标AnnexinV-FITC、单标PI,各自上机检测,调整补偿和电压,找到各自合适的位置,再测你做的双标的标本。
单凭这二张图,你目前的结果无法判度。楼上说的有一定道理,至少你的电压没调好。一般来讲,FITC测定的荧光没那样高(你已经到了1000左右),而PI的荧光也没那样低(你标为PE),从下面细胞“压变”的形态看,也说明你把PI的电压调低了。在这样的电压状态下,很难调补偿。你可以先调电压试试。
我说的“骨髓细胞的异质性问题”,是指骨髓细胞是混杂的细胞(不同的血细胞和淋巴细胞,同一系细胞不同的分化等),不太会表现很均一的结果。除非你选择特定的细胞。
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remenb[使用道具]
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谢谢大家的意见,我明天还要上一次流式,参照大家的意见看看结果会怎么样。我本来是想各做一个单标的,但是我订的抗体还没到,现在用的是借的,数量不够,所以没做。
还有一个问题想请教,要分析特定细胞的凋亡情况,是先标表面标记固定后做双染,还是用MACS阳性磁珠分选出来再标AnnexinV/PI,哪一种方法结果更理想一些?我不大清楚磁珠分选对细胞损伤有多大,本来想都试试的可是现在手头上的抗体不够用:(
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