细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]有关乳鼠心肌培养时消化下来的细胞很少的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 15  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]有关乳鼠心肌培养时消化下来的细胞很少的问题

mysmdbl[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77053
精华 0
积分 314
帖子 327
信誉分 100
可用分 2446
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
1

发表于 2012-7-31 13:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]有关乳鼠心肌培养时消化下来的细胞很少的问题



本人近期进行了5次乳鼠心肌培养，一次比一次消化下来的细胞少，本人用的是高糖的DMEM培养液加10%的小牛血清，0.25%的胰酶。共消化四次，每次消化20分钟，第一次消化的产物弃去，后3次加等量的培养基终止消化，滤网滤过1000转离心8分钟沉淀下来的细胞加培养基差速贴壁两个小时再贴壁48小时看实验结果。每次做7只鼠只能获得两个3.5cm培养皿的细胞。
本人想请各位帮忙解答一下消化细胞少与哪些因素有关，多谢!
顶部
kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
2

发表于 2012-7-31 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

注意几点：
1、0.25%的胰酶浓度太高，可以改为0.15~0.2%。
2、时间太长，每次消化只要10-12分钟就要吸去已经消化的细胞。
3、用等体积的小牛血清中止消化，离心取细胞，用血清在培养箱孵育。
4、要消化10次左右，把每次消化分离的细胞加在一起，在进行实验。
5、每次7只太少了，我做过40多只的。
6、差速贴壁1.5~2小时，与细胞活性和贴壁的培养瓶（皿）有关，要观察。
顶部
911[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73229
精华 1
积分 523
帖子 682
信誉分 102
可用分 4276
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
3

发表于 2012-7-31 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的朋友说得都对，不过有一点我意见不一，比如做组化的时候，平均一个孔一个老鼠足够的细胞密度，不一定要那么多，当然做western，流逝另外。另外，感觉还是0.1%的酶比较好，0.25的太猛了。同时也可以吹打，加快消化速度，一般4-5次就消化完毕。请楼主参考
顶部
KGZ564[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74472
精华 0
积分 452
帖子 583
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
4

发表于 2012-7-31 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们所用的胰酶浓度一般为0.08%,如果消化效果不好也可考虑一下消化温度的问题,是否能保证胰酶的最佳温度．
顶部
911[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73229
精华 1
积分 523
帖子 682
信誉分 102
可用分 4276
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
5

发表于 2012-7-31 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人感觉，温度的差异可以用吹打的方法来弥补，不一定要控制在37度的，毕竟水浴来水浴去麻烦。另外，筛网过滤是否一定需要？我每次都不用，也没发现什么不好，即使有细胞碎片可以换液来解决得。

PS：心肌细胞算是比较杂实的细胞了，经得起猛烈吹打，很多细胞比它娇嫩的。
顶部
langlang[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77033
精华 0
积分 668
帖子 976
信誉分 100
可用分 5741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
6

发表于 2012-7-31 13:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老鼠的只数不必太多，只要每次消化完全，就能够得到所需细胞数，7-8只足够了。个人认为是你消化的程度过了，我以前做也是每次离心时看到的细胞很少，为了得到更多的细胞延长离心时间，结果又损失了部分细胞。后来降低酶的浓度，每次消化10分钟，离心后都可见到细胞，状态很好。其实你可以观察，如果你收集的细胞状态好的话，贴壁的时间就早，90分钟分离就可以了，细胞悬液里大部分为心肌细胞，如果消化的不好，90分钟后成纤维细胞也不能完全贴壁。建议你从0.06%的酶浓度开始做起，或设几个浓度找出最佳条件，一定要控制好37度的环境，很重要（可以在孵箱中进行），10分钟，收集除第一次的细胞悬液。过筛网不是必要条件，我每次都做，是为了计数种板更准确些。
顶部
kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
7

发表于 2012-7-31 13:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，忽略了一个问题：你用什么配胰酶?

要用分离专用的缓冲液配制，不含钙离子。配制时先调PH值，再加入Herpers液。我现在记不住组成，上班时看了再告诉你。

太低浓度的胰酶，消化时间延长，做久了好象有点烦，对吗？
顶部
pengke1983[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 78619
精华 0
积分 470
帖子 639
信誉分 100
可用分 3986
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-1
状态 离线
8

发表于 2012-7-31 13:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

要是麻烦，直接用NaOH调节pH也行。
顶部
kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
9

发表于 2012-7-31 14:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pengke1983 于 2012-7-31 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

要是麻烦，直接用NaOH调节pH也行。

-----调PH值用0.1M的HCl，或0.1M的NaOH，调至7.2-7.4，但HERPERS要后加，否则已经缓冲了，再调很困难。要注意渗透压。
顶部
mysmdbl[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77053
精华 0
积分 314
帖子 327
信誉分 100
可用分 2446
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
10

发表于 2012-7-31 14:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位的帮忙！
我是用d-hank's液配制的胰酶配好之后调的PH值，7.3-7.4之间吧。不知道有没有问题。
顶部
 15  1/2 12››