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标题:[求助]应用红细胞裂解的方法分离小鼠脾白细胞得...

orangecake[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]应用红细胞裂解的方法分离小鼠脾白细胞得...


应用红细胞裂解的方法分离小鼠脾白细胞得1～2×10（7）/只，

但用ficoll法分离只得2×10（6）/只？？

要分离得淋巴细胞, 请问该用哪一种方法合适 ?
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发表于 2012-7-31 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是有哪种红细胞裂解的方法？我没用 ficoll法分离过，但我是用tris-NH4CL破红细胞的，每只30g 左右的小鼠得细胞数为1－5×107/只，用哪一种方法，决定你的淋巴细胞用来做什么用的
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应用红细胞裂解的方法分离小鼠脾白细胞得1～2×10（7）/只，

但用ficoll法分离只得2×10（6）/只？？

要分离得淋巴细胞, 请问该用哪一种方法合适 ?

————————————————————————————

应用红细胞裂解的方法分离的是除红细胞外的所有细胞。

用ficoll（应该是淋巴细胞分离液吧？）法分离的是淋巴细胞。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但淋巴细胞占白细胞总数的70％－90％左右，

怎么这两种方法所得的细胞数差别这么大的？
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如要做混合淋巴细胞反应时， 请问能否用红细胞裂解方法所得的细胞作
为反应细胞呢 ？？
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发表于 2012-7-31 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1，用红细胞裂解的方法分离白细胞，是根据红细胞和白细胞的细胞膜通透性的差异来分离的。其优点是可以得到较多的白细胞，缺点是得出的白细胞没有进行免疫学分类，包含了中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞，还有其他细胞成分。应用与免疫学研究不是特别广泛，具有较大的局限性。
2，用ficoll密度梯度离心法分离的是成分相对比较单一（不是绝对单一）的细胞，其原理是根据细胞密度的不同通过离心分层而获得，一般用的是1.077g/ml的分离液（根据动物种属不同而有差异），主要目标细胞群是单个核细胞（包含了单核细胞和淋巴细胞）。此类细胞目前最常用于细胞免疫学实验，包括淋巴细胞增殖试验，细胞毒性试验，ELISPOT，FACS，混合淋巴细胞反应等等。其缺点是收集的细胞数量会因为分离过程而有所减少，特别是吸取单个核细胞、洗涤细胞的时候。
3，混合淋巴细胞反应，顾名思义是用淋巴细胞的，而且一般是做T淋巴细胞为主的。因此，个人认为用红细胞裂解法分离的白细胞不适合做混合淋巴细胞反应。主要是因为其细胞成分包含了粒细胞。
以上只是我的一些认识和看法，供战友参考，共同交流学习。
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如要做混合淋巴细胞反应时， 请问能否用红细胞裂解方法所得的细胞作
为反应细胞呢 ？？

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做混合淋巴细胞反应不能用红细胞裂解方法，除了beebeeliang 战友说的细胞种类的原因外，红细胞裂解方法也会对淋巴细胞产生影响。
要想得到满意的混合淋巴细胞反应结果，需要保护好淋巴细胞。通常要注意的是：1、肝素的浓度。2、尽快分离细胞，洗净后移入培养液中。3、整个过程中不能接触具有抗原性的异物。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分离小鼠脾脏淋巴细胞不需应用肝素吧？

可感觉ficoll法分离得的淋巴细胞也太少了，如在 MLR 中需将反应细胞调至5×10（6) 较困难？

另请问 MLR 中刺激细胞和反应细胞的数量该是多少？有文献说 5×10（5), 也有文献说是 2×10（5)？
用3－H TdR标记，测cpm值，总共应培养 多少天？有文献说3天，也有文献说是 5天？
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议楼主参考一下《现代免疫学实验技术》一书，里面有讲解混合淋巴细胞反应的相关问题。我看到的有些文献用的是细胞密度呈梯度的，而且起始的细胞密度没那么大。具体还要再细看一下文献，而且不同细胞似乎不太一样。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2012-7-31 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另请问 MLR 中刺激细胞和反应细胞的数量该是多少？有文献说 5×10（5), 也有文献说是 2×10（5)？
用3－H TdR标记，测cpm值，总共应培养 多少天？有文献说3天，也有文献说是 5天？

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MLR 中刺激细胞和反应细胞的数量是各5万/孔。
用3H-TdR标记，测cpm值，应培养120小时后加3H-TdR，再培养18小时收集。
主要是在刺激后增殖最旺盛时加入，所以动物与人的细胞会有差异。
我做RAT时培养4天加3H-TdR。
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