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标题:[求助]K562/A02细胞培养的注意事项

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发表于 2012-7-31 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]K562/A02细胞培养的注意事项



大家好，我也是养细胞的新手，马上就要作实验了，需要培养K562/A02细胞，有很多事情都不知道，希望大家多多给予指导，万分感谢！
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发表于 2012-7-31 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我需要大家的帮助，细胞实在是太贵了，如果养不活就惨了！先谢谢大家了！
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发表于 2012-7-31 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

K562/AO2的培养及耐药性的维持
取K562/AO2细胞（1×105个细胞/ml）接种于25ml细胞培养瓶中，悬浮于含 100 u/ ml 青霉素、100ug/ml 链霉素以及10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，置于 37℃，5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养 。进入对数生长期后于培养基中加入阿霉素至终浓度0.6 ug/ml, 细胞在含药培养基中继续培养3至5天，换液并调整阿霉素浓度至0.8 ug/ml, 继续培养3至5天，换液并调整阿霉素浓度至1.0 ug/ml, 使细胞在1.0 ug/ml阿霉素存在下长期培养。实验前停药两周，取对数生长期细胞。
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发表于 2012-7-31 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问停药后2周做实验可以做多长时间其耐药性不变？不做时又要加药培养吗？是直接加1.0 ug/ml，还是从小浓度开始递增呢？如果打算冻存，是否须从小浓度重新诱导后再冻呢？
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发表于 2012-7-31 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有，冻时需要重新换液去掉阿霉素吗？
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发表于 2012-7-31 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般来说，培养这种细胞可以同时多养几瓶，并且都进行诱导。当阿霉素浓度从低剂量达到1.0 ug/ml后，如果培养几天细胞状态很好就可以换液停药两周，此时可以保留一两瓶细胞不停药，持续在有药物的培养基中培养。这样当你停药的细胞用完后，还需用细胞时，直接将持续药物培养的细胞停药即可，就省去了重新诱导的麻烦。

一般来说停药两周细胞耐药性可以维持很久的，足够一般试验需要，两三周都没有问题。如果不放心，可以做个MTT试验检测一下耐药性

如果你打算停试验一段时间，建议冻存。冻存方法与一般悬浮细胞一样。需要洗涤细胞，去掉阿霉素。复苏后的细胞一般都还有很强耐药性的，可以直接用，如果冻存较久，可能需要重新诱导。还是先做MTT看看吧。呵呵

提醒一点，只要是诱导，就从小剂量开始，一开始剂量太大细胞容易死。诱导过程中密切观察细胞状态，当在一种药物浓度中细胞状态不太好时，切不可急于提高药物浓度，一定维持当时药物浓度调整好细胞状态之后再提高药物浓度。一般来说整个诱导加停药过程需要一个月。

祝你好运！
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 小中大

非常感谢！还要请教很多问题呢！因为我的细胞是别的师兄给的，他已经诱导好后停药了给我的，现在停药已经快一个月了，细胞长的还行，我的MTT又没能做出来（很郁闷！）我能否现在直接冻存，复苏后能直接用吗？还是诱导后再冻呢？你做24h的MTT验正耐药性吗？耐药倍数达到多少就够了呢？你测过其P170表达吗？我用流式测的怎么只有4.2%呢？
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 小中大

非常感谢！还要请教很多问题呢！因为我的细胞是别的师兄给的，他已经诱导好后停药了给我的，现在停药已经快一个月了，细胞长的还行，我的MTT又没能做出来（很郁闷！）我能否现在直接冻存，复苏后能直接用吗？还是诱导后再冻呢？你做24h的MTT验正耐药性吗？耐药倍数达到多少就够了呢？你测过其P170表达吗？我用流式测的怎么只有4.2%呢？
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发表于 2012-7-31 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的细胞刚买回来就污染了，很惨啊!你们养这种细胞的时候都加抗生素吗？我们实验室的师兄、师姐养细胞什么都不加，所以我也就没加抗生素。加抗生素会不会对实验结果有影响啊？
新的细胞还没邮过来，我已经产生恐惧感了。我买回来的时候，那个老师说不用加阿霉素，如果耐药倍数不够再诱导就可以了，你们也是这样吗？
还有，可以赠送一些细胞吗？我买的细胞好贵啊，还养不活，再不行我都不想活了。
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 小中大

刚买来当然要加抗生素，而且是青霉素＋链霉素。
抗生素对试验有无影响要看你是做什么试验了，如果要做转染筛选就要看情况而定了，其他的试验一般都不会用无抗生素培养的。
如果是新买来的诱导好的细胞可以不用诱导直接用。
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