小中大【分享】PCR实用技巧
增加PCR的特异性：
1. primers design
这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些条件
1) 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量
2) GC% 40%~60%
3) 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
4) 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC (有人说：3' 端最好是 GC/CG/CC/GG。)
5) 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER
6) 避免3'端的错配
7) 避免内部形成二级结构
8) 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们
9) 使用兼并primer时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用 较高的primer浓度(1uM-3uM)
10) 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.
* primer的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的primer和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证primer同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比primer的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的primer。
有的是根据GC含量估算Tm。确定primerTm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测primer的杂交稳定性。大部分计算器程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及primer序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少primer二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个primer应具有近似的Tm值。primer对的Tm差异如果超过5℃，就会primer在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个primerTm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers
定制primer的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
primer产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制primer以干粉形式运输。最好在TE重溶primer，使其最终浓度为100μM。 TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核甘的水解。 primer的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的primer储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的primer在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。干粉primer可以在-20℃保存至少1年，在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月
