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标题:[求助]G418筛选

831226[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]G418筛选


请教G418筛选的具体步骤和浓度选择，特别是液氮冻存后的转染株的筛选步骤！
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般六孔板细胞转染后第二天再一分二或一分三，稳定生长24小时后，按照G418浓度设定梯度，以确定最佳浓度，防止加浓度过高细胞会全部死掉，一般剩余细胞10%-20%，具体看细胞株增值能力；浓度太低又失去筛选的目的。液氮冻存后的转染株筛选没什莫特别要处理的，细胞生长状态稳定时再筛选。祝试验顺利，仅供参考。
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831226[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

冻存复苏后的转染细胞株筛选还需要摸浓度梯度嘛？以前师兄的用量是500，可我筛后还是得不到表达株，是否需要增加浓度呢？
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831226[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在已经做脂质体瞬时转染3个月了,因为转染效率不能达到实验要求.一直在反复实验反复失败中.最近有同学说我可以做稳定转染.我非常高兴.可到园子里搜一下.发现很多不懂.比如,G418筛选浓度的确立,到底细胞是未转染的细胞还是指转染后的细胞.还有脂质体转染中48小时后,细胞应该长的很满,需要直接往培养孔中加G418吗,还是传代后加入.第一次实验中,是将转染后细胞计数稀释在培养孔中吗.的确很多不清楚.希望能及时得到帮助.谢谢
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.稳定转染是一项比较艰苦的工作，要想筛选出稳定表达的稳定株，需要很长一段时间。
2.所需的G418的浓度分为筛选浓度和维持浓度，筛选浓度需要你自己的预试验完成，将你需要转染的细胞计数后种24孔板，过夜培养，将G418调整浓度从100、200、300、－－－－－1000mg/ML,加入不同的培养孔中，两周后，细胞致死浓度的2倍为筛选浓度，筛选浓度减100为维持浓度。
3.针对脂质体转染6－8小时的细胞，更换转染复合物后，用完全培养基养48小时后，待蛋白表达后，用G418筛选。
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any333[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上如何确定细胞的死活？
用MTT染色然后酶标确定吗？谢谢
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问G418是用蒸馏水配还是用PBS配?
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

都可以，我都用过，没有什么影响。但一定要注意G418的有效效价：也就是说，你称1g G418粉剂，真正发挥功能的只有0.7g。 所以你配的时候只能按0.7g计算。
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any333[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

查到的资料说是G418用HEPES配制。
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any333[使用道具]
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发表于 2012-8-1 13:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1-G418的有效效价是怎样确定的呢？
2-用于筛选G418稳定转染的浓度时用未转染的细胞还是转染后的细胞？今天请教了一个老师说是未转染的细胞。
3-大家都是几天换一次液阿，G418是每次使用之前根据比例现加入培养基还是在配制培养基时候就已经加进了呢，另外培养基中加不加双抗？如果加了有什么影响吗？
谢谢。
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