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标题:[求助]有人用过lipofectamine2000?

bamboo16[使用道具]
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[求助]有人用过lipofectamine2000?


我想问问有哪位大侠在用invitrogen 公司的lipofectamine2000,我做的是PC12细胞。想转染质粒DNA,请教大家了。谢谢
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windy+++[使用道具]
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这种转染方法已经很成熟了,我这里简单向你介绍两句:
转染的准备:转染前1天,将105的待转染细胞传至60mm培养皿中,完全培养液培养过夜至50%-80%融合;转染DNA的准备:无水乙醇沉淀、70%乙醇洗涤后风干备用。
LipofecTAMINE脂质体介导的DNA转染:A管:于100ul无FCS的DMEM中加入2ug纯化的DNA;B管:于100ul无FCS的DMEM中加入10ul的LipofecTAMINE。将A管B管轻轻混合(C液),室温静置45分钟,见溶液变成云雾状(DNA和Lipofectamine的混合物);其间用于无FCS的DMEM洗涤细胞2次;在800ul无FCS的DMEM中加入DNA-LipofecTAMINE混合物中,混匀后轻加入细胞表面。37℃、5%CO2培养8小时,加1ml含30%小牛血清的培养基继续培养48小时。然后根据你的细胞类型采用不同浓度G418筛选就是了。
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我佛慈悲[使用道具]
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请问楼主, 你要转染什么基因?用的那个载体啊?
我最近也要用lipofectamine2000转染,我们可以交流一下。
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kulee[使用道具]
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我也用的,并且转染成功了。
lxzhi7997 说的基本是说明书上的步骤。
但我觉得不同的情况还会所不同。
比如:
(1)如果是瞬时转染,细胞数可较多;如果是稳定转染,细胞又是生长较快的,我个人觉得细胞数应较少,30-50%就行,因为太密不利于以后挑取单克隆。
(2)可能是eppendorf管透明度的关系,虽然我也听老板说过他以前也能看见DNA和脂质体混合会出现混浊的现象,但我从来没看见过,当然转染也能成功的。
(3)DNA和脂质体混合物加入细胞5h左右加入含血清的培养基,虽然说明书上写2-18h,但我发现时间长了细胞状态不好。
(4)如果是稳定转染,转染第二天按1:10传代细胞稀释,48h后加G418.
以上仅供参考,大家一起来交流。
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bamboo16[使用道具]
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我要转染关于epo 的HRE,想pGL3的载体,你呢\?
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bamboo16[使用道具]
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瞬时转染和稳定转染有什么区别吗?我不太懂啊.请指教.

你也是用的pc12 吗?

dna与lipofectamine的比例大概是多少?
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cj_mondy[使用道具]
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我上次做了一次,就按照说明书的去做,非常漂亮,而而且LIPO用量少用了一半
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bamboo16[使用道具]
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请问,你用的是pc12 吗?完全照说明书的?你用的几孔板?
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wmp1234[使用道具]
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我用pORF载体瞬时转染PC12表达Cav-1蛋白。

不过还没做呢,这几天老板催我了

Invitrogen的说明书怎么总在变呢,每次看都有变化。

还有,OptiMEM,你们用吗?不用的话,影响大吗?
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爱老虎游tt[使用道具]
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请问 你们转染时, PC12细胞形态怎样?是圆形的, 还是梭形的?我养的pc12 细胞是别人给的, 圆形的很少,大部分都是梭形的 。我的质粒上没有报告基因,因为目的基因的抗体还没到,暂时还无法检测,所以我直接作了稳定转染,期望能筛选出稳定表达克隆。但做了几次都 没有筛出来,不知道是什么原因。
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