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标题:[求助]细胞冻存于复苏问题

hustwb[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞冻存于复苏问题


如果把小鼠肝细胞+20%的DMSO,直接投入液氮，复苏后会怎样？会有多少细胞存活呢？
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DDD[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
冻存的细胞要求在状态比较好的时候才冻存这样的存活率比较高。
你直接冻存活的应该不会很高‘
在说了，冻存要慢冻，需要逐步的降温！
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milkdog[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不能肯定有多少细胞存活，但估计效果不会太好，正如楼上所说，冻存细胞细胞应该在细胞状态最好的时间冻存，一般在细胞的对数生长中晚期，细胞的数量多，状态好。而楼主冻得细胞一方面不是永生化的细胞系，在不冻存的前提下，也传不了多少代，而且冻存对细胞的损伤比较大，估计效果会更差，另一方面，冻存细胞应缓慢降温，让细胞有充分的时间吸收冻存液中的防冻剂，能在0度左右尽可能减少细胞内形成冰晶，如果迅速投入液氮中，防冻剂对细胞的作用不够充分，细胞内形成大量的冰晶，导致细胞死亡。
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发表于 2012-8-4 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前段时间偶也试着冻存又复苏了一些细胞，可是似乎复苏的成活率不是很高，是不是偶的血清加的少了，偶只加了10%。希望在冻存这方面做得好的前辈多多指点，是不是冻存的细胞密度很关键呀？
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
DMSO并不能防止细胞内结冰，在使用时需要一定时间的预冷，以充分渗透到细胞内，达到内外的平衡而起到保护作用，通常在4度下进行，不仅能减弱其对细胞的毒副作用，且能以较快的速度渗到细胞内，一般需要40-60min 然后分阶段降温到-70~-80度，再直接投入液氮保存。
若要直接投入液氮进行冷冻保存，需要利用多种高浓度冷冻保护剂组合成的保护液，配制很复杂，并不常用。
书上写的将冻存小管先悬挂在液氮罐口20min,再直接投入液氮中也可以，据说存活率可达90%。
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养的是HKC细胞,平时培养基用10%的血清即可,但冻存时需浓度高些,我用20%的血清,效果不错.
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
搂主的方法我不知道可行不！
我用 《细胞培养》司徒镇强编 的方法，认真操作，结果是复苏成活率很高，复苏后很快就长起来！
只要你按步骤操作，不用担心复苏结果，而且最好的办法就是马上试一次，临渊慕鱼，不如退而结网！
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
将细胞置 4度30mins—— －20度30mins—— －80度30mins—— 液氮，这样是不是会好一点？
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hustwb[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位老师指教，我是想比较各温度梯度下细胞存活效果，因为还曾见过有-70——液氮的说法，所以才想知道这个问题的，谢谢各位的指教！
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flower-201[使用道具]
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发表于 2012-8-4 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一般冻存细胞的步骤为：4度30分钟，-20度2小时，-80度过夜（或不超过一周），然后放到-150度或液氮中。冻存液以1：9(DMSO:完全培基)的比例冻一般的癌细胞都可以，比如卵巢癌、乳腺癌、肝癌，也可用1：4：5（DMSO：牛清：不完全培基）的比例。
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