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标题:[求助]细胞培养的PH

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发表于 2012-8-7 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞培养的PH


我们的细胞自从年后总是养不好,有贴壁的MDBK和半贴壁的SP2/0,以前的细胞向来都是养的很好的,不知道现在是不是PH的原因，其他的实验室条件都没有变化.
现象:
（1）MDBK细胞：培养基为10%DMEM，复苏后贴壁明显比以往慢，养过几天之后细胞表面便有碎屑，后来便状态日益渐差并慢慢死亡；
（2）SP2/0：培养基为10%1640，复苏后就一直长不好，大小不一，好多悬浮。
注：
配制培养基都是用PH计调至7.2，不过近来的感觉调完的培养基比以前偏酸，用普通5~9PH试纸测也是至少是7.0，再说细胞不是耐酸不耐碱的么。
望高手帮忙分析！
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-8-7 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是复苏的冻存的吗，如果是，首先考虑细胞的问题，如果不是，则考虑血清的问题，培养基的ph值有影响，但不会太大，不会有质的不同，不可能因为ph值得微小变化导致细胞死亡。
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发表于 2012-8-7 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢回复！
（1）细胞是复苏的，从-70和液氮里都两种细胞都先后试过了，结果都不好；
（2）血清是郑州佰安的，一直都用这个，也用新灭活的试过了；
（3）怀疑过细胞瓶的问题，但是用costar的一次性灭菌培养瓶还是一样；
（4）培养箱都是每周都用酒精擦拭，并及时补水；
（5）也怀疑过水的问题，用新买来的双蒸水，结果还是养不好；
好困惑！真不知道什么原因，等着用SP2/0做单抗，连这种最好养的细胞都养不好了！
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-8-7 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看来像细胞冻存的问题，不知同一批冻存的细胞年前复苏过吗，是否有相同的问题。
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lagua123[使用道具]
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 小中大

可能是细胞冻存的问题，我同学几天也是这个问题，而且她用的是GIBCO的胎牛血清，她反复换方法都不行，后来查到是冻得时候用了失效的DMSO，细胞没有很好挺过来
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发表于 2012-8-7 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

液氮罐里剩下的液氮可能是少了，不过-70里也是年前新冻的，应该没问题的吧！
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发表于 2012-8-7 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我感觉你的培养技术上不会有太大问题，因为同样的细胞以前你培养的挺好，只是现在出现了一些问题。培养基、血清和PH值可能问题不大，我的感觉可能是冻存液出了问题，你可以查查你的冻存液的配方中的成分，另外还应考虑“潜在”污染的可能性。我没有培养过你所例出的两中细胞，所以没有直接的经验，只能从细胞株以外的因素去分析，所以我的分析可能是不全面的，仅供参考。
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发表于 2012-8-7 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问题还没有解决,还得继续求助!
现在已经基本确定是培养基的PH的原因, 因为调整了一下PH 细胞马上就见好了;
可是培养基也不知道怎么了,PH 很不稳定,如刚配好的1640 ,加入20%血清后和血清的颜色差不多,太酸了,不调PH 不行,结果越调越不稳定,温浴一两次PH就变碱好多,然后再调,象造成了恶性循环似的;DMEM也一样,加入血清后PH 特别不稳定,当然调来调去的细胞长的也不好,真是急死人了!
真不知道这种情况是什么原因!望高人指教啊!
注:
1 培养基都是11年买的,上面的有效期是到14年;
2 培养基用水为双蒸水;
3 怀疑过碳酸氢钠失效失去缓冲作用,但是换了新的也不行;
4 培养基配置严格按说明书操作.
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发表于 2012-8-7 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是吧，培养基的问题，有没有添加谷氨酰氨啊？
谷氨酰氨这个东西对细胞生长还是挺重要的，而且有效时限只有一个星期多点，注意及时补加
我碰到过是细胞冻存的问题的，也是这样的情况，主要是－70的冰箱不稳定，温度摇摆，这样对细胞损耗非常大
若是冻存问题，复苏以后开始两天都要全量更换培养液，细胞很快就会恢复正常生长
至于ph影响很小，7.2到7.4都 不会有问题的，更低也没有很大影响，上了8.0的细胞还是可以生长，呵呵，不过，我的是肿瘤细胞
娇贵的细胞还是要用ph7.2到7.4的
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HPLC使者[使用道具]
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 小中大

该做的都做了,细胞还是不好啊,真急人!
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