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标题:[求助]原代HUVEC培养的问题

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-8-7 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]原代HUVEC培养的问题


我养的原代HUVEC,总是不贴壁，不知道是什么原因？请大家帮我分析一下。
我用0.25%的胰酶，37度消化5分钟。用冲洗液PBS冲洗之后,1000转离心10分钟，之后轻轻吹打，种在培养瓶中。
另外，我的培养基中加入了100U/ml的青霉素和链霉素，不知道是否对细胞的生长有影响？
我培养基的成分包括：10％FBS,5%脐血清，100U/ml的青霉素和链霉素，
ECGS 50mg/L,谷氨酰胺（3％，1ml)
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发表于 2012-8-7 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5分钟消化时间是否过长?
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2012-8-7 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

原代HUVEC,总是不贴壁，不知道是什么原因？
1.你的培养瓶没有使用明胶包被。
2.双抗对细胞的贴壁影响不大。
3.5分钟消化时间不长，常规胶原酶37度消化15min，室温（30度）消化20min
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2012-8-7 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶原酶消化对细胞损伤比较小，是否换为I型胶原酶呢
我用过sigma公司的效果不错

我还想问一下，我们都是加20％的FCS，你们为什么还要加脐血清，脐血清又是怎样来源的？
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发表于 2012-8-7 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想和胰酶消化时间有关系，可以该用II型胶原酶试一下。
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发表于 2012-8-7 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

忘记了，可以用一次性培养瓶，可以提高贴壁效率的
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发表于 2012-8-7 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的培养液是什么？

HUVEC对胰酶比较敏感，我一般都用不加EDTA的消化，而且消化时间5min也太长了吧，最好消化后将消化液吸出，避免离心对细胞造成进一步的损伤

HUVEC不是很好养，我们当时用直接购买的M200培养液，再加ECGS
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发表于 2012-8-7 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的培养液是什么？
HUVEC对胰酶比较敏感，我一般都用不加EDTA的消化，而且消化时间5min也太长了吧，最好消化后将消化液吸出，避免离心对细胞造成进一步的损伤
HUVEC不是很好养，我们当时用直接购买的M200培养液，再加ECGS
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发表于 2012-8-7 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以使用明胶或者人纤维连接蛋白包被你的板子试试，我用的就是后者。听说一次性培养瓶效果也挺好的。看来你养的是EPC吧，我也刚开始，多多交流啊。
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is2011[使用道具]
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发表于 2012-8-7 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是用板子养的原代贴壁细胞，今天第14天，昨天发现400倍下可见一些“小黑点”，有的可以移动，有杆状的和圆形的，调焦可变亮而且有亮圈。我的培养基颜色清亮，未见浑浊或沉淀，颜色粉红。我的细胞长的一直挺好的，我的细胞现在应该是污染了吧？？
昨天下午我把细胞冲洗了一下，今天“小黑点”又变多了，我该怎么处理？？如果加双抗的话应该加多少啊？那么我的细胞污染的原因是不是和在板子里培养时间较长有关？？痛苦的是我的完培里也有很少量的“小黑点”。
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