[求助]Percoll法分离细胞遇到的问题

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标题:[求助]Percoll法分离细胞遇到的问题

气泡[使用道具]
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发表于 2012-8-7 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用Percoll密度梯度离心法分离胎盘细胞，但是Percoll的分层总是不好，可以看见在45％Percoll处有胎盘细胞，但是不是呈现一个圆形的盘状，而是呈絮状分布与大约25％－55％Percoll处，而且红细胞不能完全离心到下层，有没有高手指点一下。
另外想了解一下有那些因素会影响细胞在Percoll中的分层，我在制备密度梯度的时候需要注意什么问题呢？

xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-8-7 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也用过Percoll分离细胞，但不是胎盘细胞。根据我使用时的情况，细胞分层不明显的原因可以有以下几种：
1：细胞数量太少或者过于稀释，我取一只大鼠的颌下腺，一般将细胞稀释成1ml，然后缓慢加到3～4ml的percoll液上。
2：Percoll液配制有问题。
3：离心转数不对。太多或者太少都不会有明显的分层。
4：离心机不合适。甩桶离心机的效果要比角度离心机的效果好很多。
这是我的想法，你参考一下，具体的分离条件还要你自己摸索，文献上记载的未必适合你。

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发表于 2012-8-7 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢！
我还想请教一下红细胞如果发生溶血了是否会影响分层，另外细胞如果太多或者上的液体量太多是否也有影响呢，我是用6ml加到42ml的Percoll液上。

气泡[使用道具]
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发表于 2012-8-7 16:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢。我的细胞悬液就是用DMEM 5ml将沉淀离心下来的细胞吹打开来，步骤很简单的。你说的意思是否是说我的液体量不大，但是液体里面的细胞数量过多超出了Percoll分层的能力呢？想问一下你的实验后来是怎么解决问题的呢？

气泡[使用道具]
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发表于 2012-8-7 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自己顶一下，有没有高手上来指点一下，细胞培养卡在这个环节上，急死了！

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发表于 2012-8-7 16:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

红细胞溶解了改变了红细胞的密度，对分层肯定有影响。另外，我们分离一般是percoll用2～3ml就够了，标本如果太黏稠了的话可以用hank‘s液适当稀释，另外，percoll试剂使用之前要室温平衡。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-8-7 16:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般percoll离心，1-3ml样品/8-10mlpercoll液，按这个比例你的添加量应该不大的。后来我自己反正综合了好几个方面：1.离心机用平角的；2.制样尽量标准;3.做percoll梯度液时也非常小心加层。后来做出来效果还可以的了。其次还想说一下，就是如果样品稀释太过，也分不出层的了。希望对你有帮助。

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发表于 2012-8-7 16:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主用的，很可能是在离心力的作用下，自动生成连续密度的Percoll。
由此造成：
1、不是呈现一个圆形的盘状，而是呈絮状分布与大约25％－55％Percoll处。
2、红细胞不能完全离心到下层（因为下层的比重大于红细胞的比重）。
查看一下Percoll的说明书就知道了。

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-8-7 16:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主的Percoll，是用缓冲液稀释的吧。如果缓冲液配置的时间过长的话，会影响PH值等因素。我以前做了其他的实验，用的存放久的磷酸缓冲液，没有实验结果，但更换了新配置的缓冲液，就好了。还有Percoll母液稀释成90％，和后面要稀释用的1×的缓冲液，最好是同一批次配置的。养细胞制备Percoll梯度的时候，各项之间最好不要间断。Percoll梯度配好以后，最好轻轻平移。我认为42ml的Percoll，分离细胞的耐受力还是可以的。