[求助]我培养的人原代肝细胞怎么淋巴细胞贼多？

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标题:[求助]我培养的人原代肝细胞怎么淋巴细胞贼多？

youyou99[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是用手术切除的肝组织，行原代肝细胞培养，用0.25%胰酶和0.02%Ⅳ胶原消化，1000rpm，5min，三次；行胎盘蓝染色观察，怎么全是小个细胞，问别人，说是淋巴细胞，心一下子凉了半截，后用DMEM+10%FBS培养，（96孔培养板，明胶铺板），12h后观察，还是满视野小细胞，未贴壁，中间能看到几个稍大个的细胞，打听别人，说可能是肝细胞。怎么回事啊，大家帮我想想办法，怎么去除淋巴细胞，而不损伤肝细胞，最后能得到满意数量的肝细胞？谢谢！

youyou99[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

笔误，是0.02%Ⅳ胶原酶

bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提出以下个人意见:
1.首先对于您制作原代肝细胞的方法,提出以下问题:您直接用胰酶和胶原酶消化,那么您如何去除血管里面的细胞?这是一个很关键的问题,也是混入肝细胞的杂细胞的主要来源.
2.关于"行胎盘蓝染色观察，怎么全是小个细胞，问别人，说是淋巴细胞",我觉得这种说法不太正确.因为您刚刚消化完,任何细胞都是成圆形的小细胞,怎么就能判断它到底是什么细胞呢?
3.关于"DMEM+10%FBS培养，（96孔培养板，明胶铺板），12h后观察，还是满视野小细胞",建议您改用1640+10%FBS,6孔板+鼠尾胶原,24h后观察看看情况怎么样.
关于正常原代肝细胞形态您可以参看细胞版的细胞图片
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/3168731')

youyou99[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、拿到少量肝组织后，在无菌台里，我是用剪刀去除肝被膜和肉眼可见较大的管道组织后，用D-hank液洗数次，至于小的管道组织没有处理。查了文献，也没这方面的报道。请战友赐教。
2、至于是用DMEM，还是1640，都有人用过，我查文献，DMEM多用于贴壁细胞，1640多用于悬浮细胞；另外鼠尾胶原，是自己取材，还是有公司出售？
看来如何去除杂质细胞是关键，尤其是淋巴细胞，大家有什么高招？谢谢。

kulee[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

淋巴细胞分离液？

lixi559[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没分过人的，分大鼠的，感觉你的离心是否时间太长了？

tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

淋巴细胞是悬浮生长的，而肝细胞应该是贴壁生长的啊，并且据我所知，如果没有特殊的细胞因子（比如IL-2等等），淋巴细胞是很难存活的，这样看来，至少，不需要非常担心淋巴细胞的混杂吧
当然还有很多其它细胞的混杂（管道组织中有很多细胞可能混杂的），因此还是需要冲洗的
我个人觉得最重要的是怎么样让肝细胞贴壁，只要肝细胞贴壁了，很多悬浮的细胞自然就可以区分，通过换液除掉了
一点粗浅的意见，祝实验顺利！

whitesheep[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

１＼首先，你说的淋巴细胞我觉得是不对的，没有证据说明就是淋巴细胞，消化后的细胞，所有细胞都是细小圆形的，贴壁后（悬浮细胞除外）才能显现细胞的正常形态．
２＼消化肝细胞，用胶原酶还是胰酶不是关键问题，主要是要控制消化时间．一般而言，胶原酶对细胞的损伤要小一些．消化组织，我们的做法是分二段消化：第一段：0.25%胰酶和ＰＢＳ按１；１加入，消化３－５分钟，即使收集细胞，用血清终止细胞中的酶．　后一阶段，只加0.25%胰酶，不加ＰＢＳ，消化５－８分钟，收集细胞，血清终止酶作用．
３＼肝细胞是贴壁生长的，淋巴细胞悬浮生长，特性完全不一样．换液时即可将淋巴细胞除去．
４＼你的细胞不贴壁，可能：Ａ：消化过度，细胞损伤　Ｂ：包板不佳（０.０３％的Ｉ型胶原蛋白（ＰＨ２.０）对于难贴壁的细胞，效果比别的好（仅仅是我个人的经验，供参考）　　Ｃ　肝细胞贴壁慢，一般２４小时行第一次换液，过早换液也影响贴壁
５＼关于培养基：ＤＭＥＭ适合贴壁生长的细胞，１６４０适合悬浮生长细胞（最初就是专门用来培养淋巴细胞的）．所以，你没必要换成１６４０．ＤＭＥＭ有高糖和低糖两种，如果细胞对糖没有特别要求，一般高糖ＤＭＥＭ更有利于细胞增殖，特别是增殖快的细胞．所以，如果你要换，我建议你试试高糖ＤＭＥＭ．我们用高糖ＤＭＥＭ培养过好几种细胞，效果都比低糖的好．希望对你有帮助！

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-8-11 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

消化前应该无钙灌流，去除血细胞。消化用I型胶原酶较好，最好能往血管里循环灌流，小于20min。剪碎，如果消化得好的话，呈糊状。过筛网，洗涤，50g 水平离心3min, 重复3次。活细胞计数大于85％。以150000个/cm2接种。