细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]请教流式细胞高手

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]请教流式细胞高手

loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
1

发表于 2012-8-13 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教流式细胞高手

我最近做了EGFP阳性细胞的FACS，分选过程中显示阳性率约为30%，但一管约3×106的细胞最后只分选到了约5万个阳性细胞，更要命的是，从收集管中的细胞离心之后居然什么都看不到，把转速加大至10000rpm也还是同样结果。请问这是怎么回事哪？
另外一个问题是，做流式时是根据什么来设门的，有没有具体的参数？
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
2

发表于 2012-8-13 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近做了EGFP阳性细胞的FACS，分选过程中显示阳性率约为30%，但一管约3×106的细胞最后只分选到了约5万个阳性细胞，更要命的是，从收集管中的细胞离心之后居然什么都看不到，把转速加大至10000rpm也还是同样结果。请问这是怎么回事哪？
另外一个问题是，做流式时是根据什么来设门的，有没有具体的参数？
顶部
skytree[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76459
精华 0
积分 372
帖子 444
信誉分 100
可用分 3026
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
3

发表于 2012-8-13 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提一点粗浅的建议
1、分选过程中显示阳性率约为30%，但一管约3×106的细胞最后只分选到了约5万个阳性细胞
细胞是否黏附成团？
2、从收集管中的细胞离心之后居然什么都看不到，把转速加大至10000rpm也还是同样结果
5万个细胞肉眼是观察不到的，10000rpm会损伤细胞
3、做流式时是根据什么来设门的
流式设门根据要求而定，一般会设FS（前向角，反映细胞大小），SS（侧向角，反映细胞形态结构复杂性），以及标记抗体对应的荧光通道等参数，根据要求进行组合，达到目的就行
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
4

发表于 2012-8-13 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上这位老师的解答。
我觉得我的细胞单悬液还是比较合格的，显微镜下观察绝大部分都是单个细胞，其它也就是两三个细胞一团，没有太大的细胞团，不知为什么会分离不出来。我们这里是有专人操作仪器的，他帮我设的门，凭经验来设的，圈中的细胞只占总数的26%。我只是对此有些疑问，因为我的细胞是单一的细胞系，做了转染想分选出阳性细胞而已，把门设大一些应该没多大问题吧？
顶部
ALALA[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77477
精华 0
积分 671
帖子 1002
信誉分 100
可用分 5901
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
5

发表于 2012-8-13 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

流式设门如果凭经验是不准的，科学的方法是根据同型对照（或者推一步用空白对照或阴性对照）设门。你做的是分选转染了EGFP的阳性细胞，我想应该用同系未转染EGFP的细胞作对照，根据它的荧光强度设门。这样有可能把门设的更大一些，从而显示更多的阳性细胞。
顶部
lixi559[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73492
精华 0
积分 560
帖子 820
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
6

发表于 2012-8-13 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知是在哪个门里选的细胞？
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
7

发表于 2012-8-13 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是在FSC-SSC的dot plot图里圈选的门。
阴性对照也做了，不过只是用来鉴定所设的门内的阳性细胞，并没有用来做设门的依据。
顶部
lixi559[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73492
精华 0
积分 560
帖子 820
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
8

发表于 2012-8-13 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在FSC-SSC的dot plot图里选细胞，通常需要剔除FS很小SS比较弥散的那部分颗粒（细胞碎片），如果是单一细胞株，处理过程得当，应该能看到比较明显的一团细胞和少量FS和SS都比较大的散在颗粒（细胞团），处理比较好的样品，应该能圈到70~80%左右的细胞，看来你的细胞可能处理过程有问题，如果细胞分散的还可以，那是不是碎片比较多？
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
9

发表于 2012-8-13 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

碎片我倒没认真观察过。我把设门的散点图贴上来吧，请楼上的老师指点指点，如何从FSC-SSC图中看出哪些是正常活细胞，又应如何设门。


查看积分策略说明
附件
2012-8-13 10:57
25664182.jpeg (58.94 KB)
 
顶部
lixi559[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73492
精华 0
积分 560
帖子 820
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
10

发表于 2012-8-13 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从图上可以看到大致的两群，左边的一群是碎片，右边是细胞。不会发图，细胞选取大致同意youth007 战友的那张，这样可能细胞会多一些
顶部
 12  1/2 12››